Page 48 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第9期
               ·1242 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年9月


              点进行大鼠眼眶取血，约 0.25 mL 血液样品收集在                       QC 样品，每个浓度平行制备 5 份，按前述蛋白沉降
              K2⁃EDTA 离心管中，立即以 4 ℃、6 000 r/min 离心               方法处理后进行液质分析，记录质谱响应峰面积为
              10 min，制得血浆样品，进样分析前贮存于-20 ℃环                      C。空白血浆处理后添加对照品工作液，制备QC同
              境下。                                               浓度的溶液，进样分析，记录峰面积为B。同浓度的
              1.2.4 标准血浆样品及QC样品的制备                              对照品工作液，不加血浆直接进样记录峰面积为
                  标准血浆样品：分别精密量取上述系列混合对                          A。内源性物质引起的基质效应表示为B/A×100%，
              照品工作液适量，加入 100 μL 空白血浆中，制成                        提取回收率为C/B×100%。
              6 个浓度梯度的混合标准血浆样品，含来那度胺质                                稳定性：为排除外界因素对测试结果的影响，

              量浓度范围为 1.03~515.00 ng/mL、伏立诺他 1.04~               分析血浆 QC 样品在不同储存条件下以考察稳定
              520.00 ng/mL、地塞米松 1.03~515.00 ng/mL。每个            性，分别考察样品在室温下储存 24 h 的短期稳定
              标准血浆样品中含内标（internal standard，IS）甲糖                性、在-20 ℃下储存 14 d 的长期稳定性、3 次冷冻⁃
              宁200 ng。                                          解冻循环后（-20~20 ℃）的稳定性、在 4~6 ℃下放
                  空白血浆中制备成低、中、高 3 个浓度水平的                        置在仪器进样器内 12 h 的后处理稳定性，采用冻
              QC 样品：来那度胺（1.03、103.00、515.00 ng/mL）、伏            融样品与新鲜制备的样品对照获得准确度数据。
              立诺他（1.04、104.00、520.00 ng/mL）和地塞米松（1.03、
                                                                2  结 果
              103.00、515.00ng/mL）。
              1.2.5 血浆样品处理                                      2.1 专属性
                  先加入 1 mL 甲醇冲洗，后加入 1 mL 超纯水冲                        空白样品和标准血浆样品的典型质谱图谱见
              洗以活化固相萃取小柱。取空白、标准血浆或用药                            图1，各化合物的分离度合适，血浆中的内源性物质
              后血浆样品 100 μL，置 1.5 mL 无菌离心管中，加入                   对检测无干扰。
              5 μL IS（40 μg/mL），涡旋 40 s 混匀，取混合溶液装               2.2  线性关系和LLOQ
              载进活化后的固相萃取柱，加入1 mL超纯水冲洗小                               结果表明，来那度胺、伏立诺他和地塞米松在
              柱，后加入 1.2 mL 甲醇洗脱，取甲醇洗脱液于试管                       各自的浓度范围内线性关系良好（R ≥0.995），线性
                                                                                                 2
              中，35 ℃ N2吹干，加入100 μL 80%甲醇水溶液复溶，                  方程分别为 Y=0.038 1X-0.958 9（R =0.998 3），Y=
                                                                                                 2
              涡旋振荡40 s，4 ℃低温12 000 r/min离心5 min，取上              0.006 8X-0.1308（R =0.997 9）和 Y=0.015 8X-0.723 2
                                                                                 2
              清进样 5 μL 进行分析。                                    （R =0.996 8），3 种化合物的 LLOQ 分别达到 1.03、
                                                                   2
              1.2.6 方法学考察                                       1.04、1.03 ng/mL，显示出该法适合微量分析。
                  专属性：取6份不同来源的空白大鼠血浆，配制                         2.3  精密度和准确度
              加入对照品的标准血浆样品，取大鼠灌胃服药后的                                 结果显示，来那度胺、伏立诺他和地塞米松的
              血浆样品，分别进行分析以考察方法专属性，记录                            各浓度 QC 样品的日内和日间精密度 RSD 均小于
              质谱MRM图。                                           7.4%，准确度为94.7%~106.7%（表1）。
                  线性关系和最低定量限（lower limit of quantifica⁃         2.4  提取回收率和基质效应
              tion，LLOQ）：取含IS的标准血浆样品，以血浆中被分                          分析结果见表 1。极性均较小的来那度胺、伏
              析物的浓度（x）为横坐标，被分析物与IS的峰面积比                         立诺他和地塞米松的基质效应均在92.3%~109.7%，
             （y）为纵坐标，进行线性回归（权重因子为1/x）。在信                        基质效应不明显。提取回收率在 87.4%~103.6%之
                                                    2
              噪比S/N ≥ 10时，重复分析5次标准血浆样品，其精                       间，能够满足生物样品浓度测定的要求。在实验过
              密度的相对标准偏差（relative standard deviation，            程中，考察 IS 的提取回收率和基质效应（n=5）分别

              RSD）应≤ 15%，准确度的误差在参考值 80%~120%                    为（91.7 ± 6.7）%和97.2%~104.4%。
              内的标准血浆样品中的最低浓度为LLOQ 。                             2.5  稳定性
                                                  ［21］
                  精密度和准确度：为考察日内和日间精密度与                               结果见表 2。准确度误差均符合要求［（100.0±
              准确度，用空白血浆制成低、中、高质量浓度 QC 样                         12.8）%］，结果表明来那度胺、伏立诺他和地塞米松
              品各 3 份，连续测定 3 d，用建立的定量标准曲线计                       的血浆样品在上述储存条件下性质稳定。
              算相应的质量浓度。                                         2.6 药代动力学研究
                  提取回收率和基质效应：配制低、中、高浓度的                              方法学考察后，该方法应用于大鼠血浆中来那
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