Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第10期 张天天，李金杰，柏雪雅，等. A1类清道夫受体通过促进M2型巨噬细胞极化增加脂肪组织
2023年10月 产热能力［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1333-1341 ·1335 ·
其中MSR1 为154 bp；MSR1 为202 bp。 物F4/80抗体（Abcam公司，英国）4 ℃孵育过夜。清
+/+
-/-
1.2.3 小鼠巨噬细胞清除实验 洗，二抗室温避光孵育 1~2 h，PBS 清洗，封片，滴加
给予野生型小鼠尾静脉注射氯膦酸盐脂质体 1~2 滴 DAPI 覆盖组织切片，盖上盖玻片，荧光显微
（clodronate liposomes）或对照脂质体（PBS liposomes） 镜下观察。
（200 μL/只），用以清除巨噬细胞。 1.2.7 免疫组织化学染色
1.2.4 造模小鼠体重监测与代谢笼检测 选取小鼠脂肪组织进行石蜡切片，将切片脱蜡
每周检测对照组与实验组小鼠体重并做好记 至水，依次用3% H2O2消除内源性过氧化物酶活性，
录。CD 和 HFD 小鼠造模结束后，送至南京医科大 10%牛血清封闭，加入 UCP1 抗体（Abcam 公司，英
学实验动物中心进行代谢笼检测，包括小鼠耗氧 国）4 ℃孵育过夜。清洗，生物素标记工作液室温避
量、产热量。 光孵育20 min，PBS清洗，碱性磷酸酶标记的工作液
1.2.5 小鼠造模标本收取与处理 室温孵育20 min，PBS冲洗，显色剂显色15 min，充分
造模结束后麻醉小鼠，进行眼球后静脉丛取血， 清洗，复染，脱水，透明，封片，荧光显微镜下观察。
并收取小鼠 scWAT 和棕色脂肪组织（brown adipose 1.2.8 qRT⁃PCR实验
tissue，BAT），经液氮速冻，置于-80 ℃保存，部分标 TRIzol 法提取小鼠脂肪组织总 RNA，测定 RNA
本置于4%多聚甲醛溶液中进行固定。 浓度，随后逆转录为 cDNA。通过 qRT⁃PCR 扩增目
1.2.6 冰冻组织免疫荧光染色 的基因，指标18S作为内参，校正每个样本目的基因
-ΔΔCt 值表示基因的相对表达水平，引物
选取小鼠脂肪组织冰冻切片，室温放置 30 min 的 Ct 值，以 2
后，PBS 清洗，10%牛血清封闭，加入巨噬细胞标志 序列见表1。
表1 qRT⁃PCR引物序列
Table 1 Primer sequences used in qRT⁃PCR
基因 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′）
UCP1 AGGCTTCCAGTACCATTAGGT CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT
Cidea TGCTCTTCTGTATCGCCCAGT GCCGTGTTAAGGAATCTGCTG
Cox8b GAACCATGAAGCCAACGACT GCGAAGTTCACAGTGGTTCC
Cd68 CTTCCCACAGGCAGCACAG AATGATGAGAGGCAGCAAGAGG
Tnfa ACGGCATGGATCTCAAAGAC AGATAGCAAATCGGCTGACG
IL6 GTTCTCTGGGAAATCGTGGA GGAAATTGGGGTAGGAAGGA
Mgl1 TGAGAAAGGCTTTAAGAACTGGG GACCACCTGTAGTGATGTGGG
18S CATTCGAACGTCTGCCCTATC CCTGCTGCCTTCCTTGGA
1.2.9 Western blot实验 于预冷的PBS中。消化、过滤、种板。细胞生长完全
提取小鼠脂肪组织总蛋白，通过BCA法测定蛋 融合后进行诱导分化。
白浓度，每个样品孔按40 μg蛋白总量上样，随后进 1.2.12 小鼠原代腹腔巨噬细胞分离与培养
行电泳、转膜、封闭、一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵 小鼠处死后 75%乙醇浸泡，用注射器将含有
育2 h，最后进行显色成像。 100 μg/mL 肝素的 PBS 注入小鼠腹腔中进行冲洗，
1.2.10 流式细胞术检测小鼠脂肪组织中血管基质 将冲洗液吸取入针管内，注入离心管中。离心后弃
成分 上清，加入培养液重悬，放置在 37 ℃培养箱中培
收取小鼠scWAT置于1% FBS中，滤纸吸干，充 养。
分剪碎组织，移至离心管中。使用Ⅱ型胶原酶消化 1.3 统计学方法
60 min。200 目筛网过滤至 EP 管，离心。加入 1 mL 使用 GraphPad Prism 8 软件进行数据分析。数
红细胞裂解液，离心，PBS洗3遍。加入200 μL PBS 据均用均数±标准误（x ± sx ）表示。在统计分析前对
重悬，加入相应抗体，室温避光孵育 60 min，离心， 数据的分布进行假设检验后，对满足正态性和方差
PBS洗3遍。加入250 μL PBS重悬并上机检测。 齐性的数据采用两样本独立t检验或单因素方差分
1.2.11 小鼠原代白色前脂肪细胞分离并诱导分化 析，对不满足正态性或方差齐性的数据采用Kruskal⁃
小鼠处死后75%乙醇浸泡，收取小鼠scWAT置 Wallis H检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
