Page 47 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第3期 丁浩南，严 佳，唐诗佳，等. 佛手柑内酯对人牙髓干细胞成骨分化的影响［J］.
2023年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（3）：334-342 ·337 ·

表1 qRT⁃PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of qRT⁃PCR

基因名 上游序列（5′→3′） 下游序列（5′→3′）
GAPDH GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA
RUNX2 ATGATGACACTGCCACCTCTG GGCTGGATAGTGCATTCGTG
ALP GAGGATGCCGCTCTGTGA GCTCTTGCGTGGGTTTCG
OCN TGCAAAGCCCAGCGACTCT TTGAGCTCACACACCTCCCTGT
OPN ATGATGGCCGAGGTGATAGT ACCATTCAACTCCTCGCTTT

丙烯酰胺凝胶电泳在90 V电压下分离，经300 mA恒 流式细胞仪鉴定结果显示，所提取的细胞表面表达
流转膜，蛋白转移至PVDF膜上，室温下用快速封闭 的标志物中，CD34 及 CD45 表达呈阴性，而 CD105、
液封闭15 min，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下用TBST CD29、CD73和CD166表达阳性（图1 B~H）。这说明
洗涤5次，每次6 min，与对应二抗孵育50 min，将膜 所提取的hDPSC有干细胞特性，可以用于后续实验。
转移至暗盒中，滴加化学发光底物混合物，在化学 2.2 BP对hDPSC增殖的影响
凝胶发光成像系统下显影拍摄。灰度值数据用 为了评估 BP 对 hDPSC 增殖的影响，将细胞培
Image J进行测算。 养于含不同 BP 浓度的完全培养基中。细胞毒性实
1.3 统计学方法 验结果显示，当 BP 浓度超过 60.0 μmol/L 后，其对
所有实验至少进行3次重复，实验数据用均值± hDPSC的毒性显著上升，差异有统计学意义（图2 A，
标准差（x ± s）表示，使用 GraphPad Prism9 进行数据 P < 0.01）。而 7.5~30.0 μmol/L 范围内 BP 对 hDPSC
分析，组间比较采用单因素方差分析和新复极差法 的增殖未见明显抑制作用。生物安全性结果显示，与
检验，P < 0.01为差异有统计学意义。 对照组相比，在5 d时7.5、15.0、30.0 μmol/L BP 对细
胞增殖有一定促进作用（图 2B，P < 0.01），第 7 天时
2 结 果
BP 组间无明显差异。后续成骨诱导实验采用 7.5、
2.1 hDPSC的分离与鉴定 15.0、30.0 μmol/L作为BP的实验浓度。
胶原酶消化法提取的细胞在第7天时从组织块 2.3 细胞形态观察
中爬出，细胞呈类成纤维细胞样的梭形（图 1 A）。 荧光显微镜下观察各组细胞均未见显示死细

A B C D
PE⁃A - PE⁃A + 800 PE⁃A - PE⁃A + 800 PE⁃A - PE⁃A +
800
99.6 0.38 99.4 0.59 99.5 0.54
600
Count 600 Count 400 Count 600
400
400
200 200 200
0 0 0
0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5
PE⁃A∶∶PE⁃A PE⁃A∶∶PE⁃A PE⁃A∶∶PE⁃A
E F G H
PE⁃A - PE⁃A + PE⁃A - PE⁃A + PE⁃A - PE⁃A + PE⁃A - PE⁃A +
150 0.73 99.3 120 0.18 99.8 120 0.43 99.6 200 0.012 100.0
Count 100 Count 90 Count 90 Count 150
60
100
60
50
30 30 50
0 0 0 0
0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5
PE⁃A∶∶PE⁃A PE⁃A∶∶PE⁃A PE⁃A∶∶PE⁃A PE⁃A∶∶PE⁃A
A：原代细胞形态（×100）；B：细胞自身荧光；C：加入CD34抗体的样本；D：加入CD45抗体的样本；E：加入CD105抗体的样本；F：加入CD29
抗体的样本；G：加入CD73抗体的样本；H：加入CD166抗体的样本。
图1 原代hDPSC形态及流式细胞术检测干细胞表面标志
Figure 1 Morphology of the primary hDPSC and flow cytometry analysis of surface antigen markers of stem cells