Page 46 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第3期
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             （Thermofisher公司，美国）。                               的培养基替换原培养基，对照组加入等体积的
              1.2  方法                                           DMSO。于第 3 天加入 LIVE/DEAD 细胞成像试剂，
              1.2.1 细胞培养                                        37 ℃孵育15 min后于倒置荧光显微镜下观察。
                  收集从南京医科大学附属口腔医院治疗的年                           1.2.5 BCIP/NBT ALP显色及ALP定量检测
              轻患者（18~25岁）处拔除的健康第三磨牙并从中提                              将 hDPSC 以 2×10 个/孔的密度接种于 12 孔板
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              取牙髓组织。本研究已获南京医科大学附属口腔                             中，每孔加入 1 mL 含 10% FBS α⁃MEM 培养基。待
              医院伦理委员会批准（伦理审批号：PJ2021⁃125⁃                       其融合度达 60%时，用含不同浓度 BP（7.5、15.0、
              001），所有患者知情同意。用含1%双抗的PBS冲洗                        30.0 μmol/L）的成骨诱导培养基替换原培养基，对照
              牙齿表面后，于超净工作台中取出牙髓组织，眼科剪                           组使用含等体积DMSO的成骨诱导培养基。每2~3 d
              剪碎，然后将组织碎块置于3 mg/mL Ⅰ型胶原酶溶液                       换 1 次液。成骨诱导 7 d 后，吸弃诱导培养基，PBS
              中，37 ℃消化20~30 min后，1 000 r/min 离心5 min，弃          冲洗2次，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，吸弃，

              上清，将沉淀吹打混匀后接入培养皿中，用含 20%                          PBS 冲洗 2 次，按 BCIP/NBT ALP 显色试剂盒说明书
              FBS和1%双抗的α⁃MEM 培养基培养。待细胞爬出                        所示方法配置染色液，每孔加入 500 μL，室温下避
              后，弃组织块，继续培养，记为 P0，每 3 d 换液 1 次，                   光染色 15 min后，去离子水轻洗去除非特异性染色
              当细胞汇合度为70%~80%后，胰酶消化传代。选取                         并中止染色反应，于扫描仪拍照观察，并于镜下观
              第2~6代细胞进行后续实验。后续成骨指标检测实                           察。取同样方式培养至 7 d 的 hDPSC，吸弃培养基，
              验使用人相关干细胞成骨诱导培养基进行。                               PBS冲洗2次后每孔加入0.5% TritonX⁃100，冰上裂解
              1.2.2 细胞鉴定                                        20 min，超声破碎，12 000 r/min离心15 min后取上清
                  采用流式细胞仪检测 hDPSC 的表面标志物。                       液进行ALP活性和总蛋白浓度检测，检测按ALP试
              第 2 代 hDPSC 用于流式表型检测。将细胞接种于                       剂盒与BCA总蛋白定量试剂盒所示方法进行。
              2 个 T25 培养瓶中，待细胞融合达 80%时，用胰酶消                     1.2.6 ARS检测
              化，1 000 r/min 离心5 min后弃上清，用流式细胞缓冲                      细胞培养方法同1.2.5。成骨诱导至21 d时，吸
              液重悬，调节细胞浓度为3×10 个/孔，取100 μL细胞                     弃原培养基，PBS 冲洗 2 次，每孔加入 4%多聚甲醛
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              悬液至1.5 mL EP管中，每管约3×10 个细胞。对EP                    固定 30 min，吸弃，PBS 冲洗 2 次，每孔加入 500 μL
              管进行标记，每管加入对应的3 μL一抗，混匀；4 ℃过                       ARS 染色液，室温染色 10 min，吸弃染液，PBS 漂洗
              夜，冲洗；加入荧光二抗，孵育；冲洗，过筛；使用流式                         后扫描仪拍照，并于镜下观察钙结节形成情况。取
              细胞仪定量细胞荧光，数据使用FlowJo10.4分析。                       同样方法诱导及ARS染色的细胞，加入10%氯化十
              1.2.3 细胞毒性及生物安全性检测                                六烷基砒啶溶液，反应 15 min 后，微孔板分光光度
                  CCK⁃8 检测 BP 对 hDPSC 的毒性及生物安全                  计于562 nm处测定吸光度。
              性。在细胞毒性检测实验中，hDPSC 以 3×10 个/孔                     1.2.7 实时荧光定量PCR
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              的密度接于 96 孔板。每孔加入 200 μL 含 10% FBS                      细胞培养方法同 1.2.5。成骨诱导至 7 d 时，吸
              的 α⁃MEM 培养基，4 h 后用含不同浓度 BP（7.5~                   弃培养基，按照RNA提取试剂盒所示方法收集细胞
              240.0 μmol/L）的培养基替换原培养基，对照组加入                     并分离提取总 RNA，逆转录成 cDNA 后，采用 TB
              等体积的 DMSO。3 d 后吸弃孔内培养基，加入                         Green premix EX Taq Ⅱ试剂盒所示方法配置10 μL
                                                                     TM
                                                                                    TM
              150 μL 按1∶10用α⁃MEM培养基稀释后的CCK⁃8工                   反应体系，在 Quant studio7 荧光定量 PCR 仪上进行
              作液，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h后，每孔吸出                    实时荧光定量分析。引物由上海生工生物工程有
              100 μL液体至另一96孔板中，微孔板分光光度计在                        限公司合成（表 1），GAPDH 管家基因作为内参，用
              450 nm处读取吸光度值。生物安全性检测实验中，                         比较阈值循环法分析。
              hDPSC以 5×10 个/孔的密度接种于96孔板中，4 h后                   1.2.8 免疫印迹分析
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              用含不同浓度BP（7.5、15.0、30.0 μmol/L）的培养基替                    细胞培养方法同 1.2.5。成骨诱导至 7 d 时，用
              换原培养基，于0、1、3、5、7 d用CCK⁃8法进行检测。                    含 1%蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液冰上裂解细胞，
              1.2.4 细胞形态检测                                      超声破碎后 12 000 r/min 离心 15 min，收集上清液，
                  将 hDPSC 以 5×10 个/孔的密度接种于 96 孔板                加入5×SDS蛋白上样缓冲液后100 ℃煮8 min，冷却
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              中。4 h后用含不同浓度BP（7.5、15.0、30.0 μmol/L）              后于-20 ℃储存。蛋白样品通过十二烷基硫酸钠聚
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