Page 26 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第7期
·912 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年7月

A
Ctrl pH5+DCA 2 h pH5+DCA 4 h pH5+DCA 6 h pH5+DCA 8 h

5 μm 5 μm 5 μm 5 μm 5 μm
B 125 0 h
2 h
一一一一一一一一
一一一一一一一一 4 h
100 一一一一一一一一 6 h
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（ % ） 75 * * * 丈丈丈丈丈丈丈丈 8 h
存活率 一一一一一一一一 一一一一一一一一
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50 μmol/L 100 μmol/L 200 μmol/L 300 μmol/L
A：酸性 DCA 对 HEEC 形态的影响；黑色箭头表示细胞空泡，标尺为 5 μm（×200）；B：酸性 DCA 对 HEEC 存活率的影响；与对照（0 h）
组比较，P < 0.001（n=6）。
*
图1 酸性DCA处理后HEEC存活率及形态变化
Figure 1 Viability and morphological changes of HEEC treated with acidic deoxycholic acid
MMP 显著降低。用酸性 DCA（100 μmol/L）处理 2.4 酸性DCA激活cGAS⁃STING信号通路
HEEC 4 h 后，如图 2G 所示，与对照组相比，酸性 用酸性 DCA（100 μmol/L）处理 HEEC 4 h 后，与
DCA 刺激后细胞 ATP 水平降低。运用透射电镜观 对照组相比，酸性 DCA 组 cGAS、STING 及 p⁃NF⁃κB
察线粒体超微结构，如图 H 所示，对照组线粒体结 p65蛋白表达增加，RT⁃qPCR结果显示炎症因子IL⁃6
构完整，轮廓清晰，线粒体嵴排列有序，基质均匀； 及 IL⁃1β表达水平增加（图 4A、B）。cGAS 抑制剂
酸性 DCA 处理后线粒体外形肿胀，线粒体嵴排列 RU.521 预 处 理 抑 制 了 酸 性 DCA 诱 导 的 cGAS、
紊乱，稀疏，线粒体出现空泡化。上述结果表明， STING及p⁃NF⁃κB p65表达水平的升高，同时炎症因
酸性 DCA 诱导 HEEC 线粒体形态改变及功能障 子IL⁃6及IL⁃1β表达水平降低（图4C、D）。
碍。
3 讨 论
2.3 酸性 DCA 导致 HEEC DNA 双链断裂及 mtDNA
拷贝数减少及释放 GERD 是全球最常见的慢性疾病之一，具有死
用酸性 DCA（100 μmol/L）处理 HEEC 4 h 后，荧 亡率低但发病率高的特点，RE是GERD常见的类型
光显微镜下观察γH2AX 阳性细胞，结果如图 3A 所 之一 。研究表明，酸性胆盐刺激食管上皮细胞分
［1］
［3］
示，与对照组相比，酸性 DCA 处理后γH2AX 阳性细 泌IL⁃8及IL⁃1β等细胞因子 ，MAPK、PKC及PKA等
胞数显著增加。Western blot 结果如图 3B 所示， 信号通路介导了这一过程 ［10-11］ 。本研究采用酸性
γH2AX 蛋白表达水平高于对照组。为了验证酸性 DCA 刺激人正常食管上皮细胞的方法初步模拟RE
DCA 处理后 mtDNA 是否从线粒体释放到胞质中， 的发生发展过程，探讨 mtDNA 损伤及释放与 cGAS⁃
RT⁃qPCR 检测 mtRNA 基因 ND⁃1、ND⁃2 相对细胞核 STING 通路在食管上皮炎症中的关联。结果表明，
DNA 基因 B2M 的表达水平，结果显示，酸性 DCA 处 酸性DCA诱导线粒体功能障碍，进一步导致mtDNA
理后 mtDNA 拷贝数显著降低（图 3C）。进一步用荧 双链断裂及释放，激活cGAS⁃STING 通路，促进下游
光显微镜观察了线粒体与 DNA 共定位情况，如图 炎症因子的分泌。
3D 所示，对照组中，mtDNA 位于线粒体内部，酸性 近年来，线粒体在疾病发生发展中的作用备受
DCA 处理后 mtDNA 从线粒体释放到胞质中。上述 关注。内源性ROS主要在线粒体呼吸链上产生，在
结果表明，酸性 DCA 诱导 HEEC 双链 DNA 断裂，导 正常机体内，ROS 的产生和清除受到严格控制，当
致DNA损伤，mtDNA释放至胞质中。 体内氧化和抗氧化系统处于失衡状态时，ROS 的清