Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第7期
·910 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年7月

levels of cGAS and STING were inhibited and the expression of p⁃NF⁃κB p65 was partially inhibited，and the levels of inflammatory
cytokines IL⁃6 and IL⁃1β were decreased. Conclusion：The in vitro experiments have shown that acidic deoxycholic acid can induce
mitochondrial dysfunction，mitochondrial DNA damage and release，and mediate HEEC inflammation. The mechanism may be related
to the activation of cGAS⁃STING pathway.
［Key words］ reflux esophagitis；mtDNA；cGAS⁃STING pathway
［J Nanjing Med Univ，2023，43（07）：909⁃916］

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease， 发病机制提供新的理论依据。
GERD）是上消化道的慢性疾病，其发病率逐年升
1 材料和方法
高 。反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是胃食
［1］
管反流病的常见类型之一，盐酸及胆汁酸等反流物 1.1 材料
质的长期刺激会导致食管远端的炎症反应，并随 人正常食管上皮细胞系（HEEC）购自美国ATCC。
着反流时程的延长进展至 Barrett 食管甚至食管腺 去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA，MedChemExpress
癌 。既往研究发现，暴露于酸性胆盐的食管上皮 公司，美国），CCK⁃8试剂盒（APE×BIO 公司，美国），
［2］
［3］
细胞炎症因子分泌显著增加 。然而，盐酸及胆汁 ROS检测试剂盒、线粒体膜电位（mitochondrial mem⁃
酸诱导食管上皮炎症的确切机制尚未完全阐明，深 brane potential，MMP）检测试剂盒及 ATP 检测试剂
入探讨介导食管上皮炎症的具体机制能为RE的治 盒（上海碧云天科技公司），线粒体活性氧（mitochon⁃
疗提供新的理论依据。 drial reactive oxygen species，mtROS）Mitosox 荧光探
线粒体是内源性活性氧（reactive oxygen species， 针（Invitrogen 公司，美国），细胞基因组 DNA 提取试
ROS）生成的主要部位，大量ROS诱导的氧化应激会 剂盒（北京天根生化科技公司），HiScript ⅡQ RT
®
导致线粒体功能障碍。作为线粒体遗传物质存在 SuperMix 和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京诺
的线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）靠近呼 唯赞公司）；cGAS抗体及γH2AX抗体（Cell Signaling
吸链且缺乏保护性组蛋白，因此极易受到ROS的攻 Technology 公司，美国），STING 抗体和 TOMM20 抗
击，导致 mtDNA 损伤并从线粒体释放到胞质中 。 体（Abcam 公司，美国），p⁃NF⁃κB p65 抗体和 NF⁃κB
［4］
作为线粒体损伤相关分子模式（mitochondrial damage⁃ p65抗体（上海Abmart公司），抗DNA抗体（Progen抗
associated molecular pattern，mtDAMP），mtDNA 可以 体，德国），β⁃actin抗体（北京博奥森生物公司）。
通过结合模式识别受体（pattern recognition receptor， 1.2 方法
PRR）激活固有免疫系统 ［5-6］ 。 1.2.1 细胞培养和处理
环鸟苷酸⁃腺苷酸合酶（cyclic GMP⁃AMP synthase， 使用含 20%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基，在
cGAS）作为 PRR 之一是胞质 DNA 感受器，能识别 5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。当细胞生长至融合
并结合胞质双链DNA，催化ATP和GTP转化为环二 度达 80%左右时传代并进行后续实验。酸性 DCA
核苷酸cGAMP，其作为第二信使结合并激活干扰素 溶液的配制如下：酸性培养基用 36%~38%的浓盐
基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）， 酸在 DMEM 培养基中滴定至 pH=5，在此酸性培养
随后 STING 招募并激活 TANK 结合激酶 1（TANK 基中加入一定量的 DCA 贮备液配成含不同浓度
binding kinase 1，TBK1）和 IκB 激 酶（IκB kinase， DCA 的酸性培养基，充分混匀后即为酸性 DCA 溶

IKK），这些激酶磷酸化并激活干扰素调节因子 3 液。对照组即为不含DCA的中性培养基，即DMEM
［3］
（interferon regulatory factor 3，IRF3）和 核 因 子 κB 培养基 。
（nuclear factor kappa⁃B，NF⁃κb），促进Ⅰ型干扰素 1.2.2 CCK⁃8实验检测细胞活性
及其他细胞因子的表达。cGAS⁃STING 通路参与 HEEC 接种于 96 孔板，1×10 个/孔，贴壁生长
5
炎症性疾病、神经退行性疾病及肿瘤等多种疾病 24 h，酸性DCA组设置50、100、200、300 μmol/L 4个
进程 ［7-9］ 。本研究拟探讨酸性DCA诱导食管上皮炎 浓度及2、4、6、8 h 4个时间点，同时设置对照组及空
症过程中，mtDNA 损伤及释放与 cGAS⁃STING 通路 白组，CCK⁃8 试剂盒测定细胞存活率，细胞存活率=
之间的联系，为酸性胆盐反流引起慢性食管炎症的 ［（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度-