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第43卷第7期 张丹萍，苏 鑫，朱 宏. cGAS⁃STING通路介导酸性去氧胆酸诱导人正常食管上皮细胞
2023年7月 炎症的机制研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：909-916 ·911 ·

空白孔吸光度）］×100%。 因组 DNA 提取试剂盒说明书进行 DNA 提取，紫外
1.2.3 流式细胞术检测ROS、mtROS和MMP 分光光度计测定 DNA 浓度及纯度，以基因组 DNA
将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接 为模板进行 RT⁃qPCR 扩增，mtDNA 拷贝数的检测
种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，PBS润洗后胰 以 细 胞核 DNA 作为参照，B2M 基因代表细胞核
酶消化离心，将探针稀释在特定溶液中孵育一定时 DNA，ND1 及 ND2 基因代表 mtDNA。ND1 上游引
间，孵育结束后离心并清洗，上机检测。 物：5′⁃CTCTTCGTCTGATCCGTCCT⁃3′，下游引物：
1.2.4 荧光显微镜检测ROS、mtROS和MMP 5′⁃TGAGGTTGCGGTCTGTTAGT⁃3′；ND2 上游引物：
将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接 5′⁃GTAGACAGTCCCACCCTCAC⁃3′ ，下 游 引 物 ：
种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，PBS润洗后加 5′⁃TTGATCCCGTTTCGTGCAAG⁃3′；B2M 上游引物：
入荧光探针孵育，孵育结束后吸弃并清洗，荧光显 5′⁃CCAGCAGCGAATGGAAAGTCAA⁃3′，下游引物：
微镜采集图像。 5′⁃TCTCTCTCCATTCTTCAGTAAGTCAACT⁃3′。
1.2.5 ATP检测 1.2.9 Western blot
将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白
种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，使用ATP检测 浓度并确定上样量，SDS⁃PAGE凝胶进行电泳，电泳
试剂盒进行检测，配制不同浓度梯度的ATP标准溶 结束后冰浴转膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，一
液，绘制标准曲线，将 ATP 检测工作液加入样品和 抗 4 ℃孵育过夜，隔日二抗室温孵育 1 h，ECL 化学

标准品中，使用光度计检测相对光单位（relative 发光显影。
light unit，RLU）值。BCA法检测蛋白浓度，ATP含量 1.3 统计学方法
=ATP浓度/蛋白浓度。 所有数据均使用 GraphPad Prism8 软件进行分
1.2.6 细胞免疫荧光 析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，两组间比
将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接 较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事
种于共聚焦小皿，待细胞贴壁后给药处理，4%多 后比较采用 Tukey 检验。P < 0.05 为差异有统计学
聚甲醛室温固定 20 min，0.1% Triton X⁃100 室温破 意义。
膜 15 min，5% BSA⁃PBS 室温封闭 2 h，一抗 4℃孵育
2 结 果
过夜，隔日二抗避光室温孵育 1 h，DAPI 室温复染
10 min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下采集图像。 2.1 酸性DCA对HEEC细胞形态和存活率的影响
1.2.7 实时荧光定量PCR（RT⁃qPCR） 倒置显微镜下观察酸性DCA（100 μmol/L）处理
TRIzol 法提取细胞总 RNA，紫外分光光度计 前后HEEC形态变化，对照组中，细胞贴壁生长且状
测定 RNA 浓度及纯度，按照逆转录试剂说明合成 态良好，形态饱满。随着药物作用时间的延长，细
cDNA，以 cDNA 为模板进行 RT⁃qPCR 扩增。IL⁃1β 胞逐渐皱缩，空泡增多（图1A）。为了探究酸性DCA
上游引物：5′⁃AGCTACGAATCTCCGACCAC⁃3′，下游 对HEEC 存活率的影响，将不同浓度酸性DCA 溶液
引物：5′⁃CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA⁃3′；IL⁃6上 处理细胞 2、4、6、8 h，CCK⁃8 法检测细胞存活率，结
游引物：5′⁃ACTCACCTCTTCAGAACGAATGG⁃3′，下 果如图1B所示，HEEC的存活率随着浓度的增加及
游引物：5′⁃CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG⁃3′；以 暴露时间的延长而降低，呈浓度⁃时间依赖性。当干

GAPDH 为内参，上游引物：5′⁃ACCATCTTCCAG⁃ 预浓度为 200 μmol/L 及 300 μmol/L 时，细胞存活率
GAGCGAG⁃3′，下游引物：5′⁃GATGGCATGGACTGT⁃ 极显著降低。当干预浓度为50 μmol/L及100 μmol/
GGTCA⁃3′。RT⁃qPCR 反应条件：预变性 95 ℃ 30 s； L 时，与对照组相比，细胞存活率下降，且差异具有

40 次循环反应 95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s；95 ℃ 统计学意义（P < 0.001），依据既往研究 ［10-11］ ，本研究
变性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃变性15 s。以GAPDH 中选择100 μmol/L作为后续实验的干预浓度。
作为内参，采用２ -ΔΔCt 法计算目的基因mRNA相对表 2.2 酸性DCA诱导HEEC线粒体功能障碍
达量。 用酸性 DCA（100 μmol/L）处理 HEEC 2 h 后，荧
1.2.8 mtDNA拷贝数测定 光显微镜及流式细胞仪检测细胞内 ROS、mtROS 和
将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接 MMP 水平。如图 2A~F 所示，与对照组相比，酸性
种于 6 孔板，待细胞贴壁后给药处理，按照细胞基 DCA 处理后细胞内 ROS 及 mtROS 水平显著升高，