Page 43 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 43

第43卷第7期         谢 雯，董洪权，侍崇龙，等. 脑膜淋巴管转运功能障碍加重脂多糖诱导的小鼠中枢炎症［J］.
                  2023年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：927-933                       ·929 ·


                后各取4只进行实验。Control 组4只给予相同体积                       多聚甲醛进行灌注，取出大脑，用 4%多聚甲醛固
                的生理盐水腹腔注射，作为对照。                                   定 24 h，蔗糖溶液梯度脱水，待沉底后用 OCT 胶
                    其次将 8 只小鼠随机分为 2 组，分别为 Control                 包埋脑组织，固定后连续切片（厚度 10 μm），选
                组和 MAZ51 组，将 MAZ51 溶解于二甲亚砜中，以                     出 海 马 切 片 ，用 PBS 清 洗 后 在 常 温 下 放 入 3%
                10 mg/kg腹腔注射，持续30 d，每周5 d，共6周，对照                  H2O2 中浸泡 10 min，洗涤后用 5% BSA 封闭液中封
                组给予相同体积的二甲亚砜             ［15］ 。42 d后枕大池注射         闭 1 h，加入用 1% BSA 稀释后的一抗（1∶200），在
                荧光标记蛋白 OVA⁃647（3 μL），1 h 后处死小鼠，取                  4 ℃冰箱中过夜，次日用 PBS 洗涤 3 次后加入相应
                dCLN、硬脑膜进行分析。                                     的二抗，孵育 1 h 后 PBS 洗涤 3 次，用 DAPI 封片。
                    另取 24 只小鼠随机分为 Control 组、MAZ51 组、              选取海马 CA1 和 CA3 区拍照。细胞计数应用 NIH
                LPS组、LPS+MAZ51组，每组6只。用相同的方法腹                      Image J 软件。
                腔注射MAZ51，42 d后将小鼠放入行为学仪器中进                        1.2.5  ELISA
                行训练，30 min后对LPS组和LPS+MAZ51组腹腔注                        使用小鼠 IL⁃6、IL⁃1β Quantikine ELISA 试剂盒
                射LPS，其余两组注射相同体积的生理盐水。1 d后                         测量小鼠海马组织匀浆中细胞因子 IL⁃6、IL⁃1β水
                进行行为学实验，实验结束后处死小鼠，取海马进                            平。具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。
                行分析。                                              1.2.6  逃避恐惧实验
                1.2.2  脑枕大池立体定位注射                                     逃避恐惧实验用来评估小鼠的海马依赖性记
                    腹腔注射 50 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉小鼠，颈部                    忆。训练小鼠将无条件刺激（足部电击）和条件刺
                皮肤剃毛消毒后放入脑立体定位仪中并三角固                              激（音调）与环境联系起来。先进行训练，将小鼠
                定。切开皮肤，暴露枕大池，用Hamilton微量注射器                       放入 TFC 仪器中自由探索 100 s，然后给予小鼠听
                吸取 OVA⁃647（3 μL）以 2 μL/min 的速率注入枕大                觉刺激 20 s（80 db，5 kHz），后立即给予足底电击
                池中。注射后，将注射器停留在原处 2 min，以免                        （0.8 mA），重复 2 次，中间间隔 100 s。刺激结束后
                CSF回流，然后缝合颈部皮肤，让小鼠在加热垫上恢                          30 min 腹腔注射LPS，1 d后评估小鼠学习恐惧的情
                复至完全清醒。                                           景记忆，通过视频跟踪软件（Xeye Fcs，北京天鸣鸿
                1.2.3  免疫荧光染色                                     远科技发展有限公司）自动记录小鼠300 s内除呼吸
                    麻醉小鼠后剪开颈部皮肤，向下牵拉胸锁乳                           以外没有任何运动的僵直反应时间。
                突肌，暴露 dCLN 并用镊子取出，放入 4%多聚甲                        1.3  统计学方法
                醛中固定 24 h，用 20%和 30%的蔗糖梯度脱水后                          采用 SPSS 25.0 软件行统计学分析，计量资料
                连 续 冰 冻 切 片（厚 度 10 μm），用 PBS 洗 去 残 余              以均数±标准差（x ± s）表示，采用单因素方差分析
                OCT 包埋胶后 DAPI 封片。取完 dCLN 后用生理                     和 t 检验确定差异显著性。P < 0.05 为差异有统计
                盐水和 4%多聚甲醛灌注心脏，剪去颈部肌肉，剥                           学意义。
                出头盖骨，放入 4%多聚甲醛中固定 24 h，PBS 洗
                                                                  2 结    果
                涤 1 遍，在显微镜下用镊子剥出硬脑膜，贴在载
                玻片上，烘干。                                           2.1  LPS腹腔注射对mLV转运功能的影响
                    LYVE⁃1 染色：脑膜用 PBS 洗涤后，在室温下用                       小鼠腹腔注射 LPS，12、24、72 h 后于枕大池中
                含2 g/L Triton X⁃100牛血清白蛋白孵育1 h，加入带                注射OVA⁃647（3 μL），取脑膜和dCLN 进行分析，如
                有红色荧光基团的兔抗⁃LYVE⁃1（1∶200），在 4 ℃冰                   图 1 所示，与 Control 组相比，LPS 组小鼠脑膜中
                箱中孵育过夜，次日用PBS洗涤（5 min × 3次）后，用                    mLV 标志物 LYVE⁃1 面积、dCLN 的 OVA⁃647 荧光
                DAPI封片。                                           面积明显减少，差异具有统计学意义，其中 24 h 时
                    封片后使用 Thunder Imager 快速高分辨倒置荧                 达到最低，72 h 时面积有所回升，仍低于基础水
                光成像系统（LEICA 公司，德国）扫描拍照。计算                         平。取小鼠海马分析 MG 活化情况和炎症因子水
                mLV内皮细胞标志物LYVE⁃1荧光面积以及淋巴结                         平，MG 活化标志物 Iba⁃1、炎症因子 IL⁃6、IL⁃1β水
                内OVA⁃647荧光占整个淋巴结面积的百分比。                           平在 24 h 达到最高（P < 0.01，图 2），72 h 回落，说
                1.2.4  免疫组织化学染色                                   明 LPS 导致 mLV 转运功能下降，并随着时间有所

                    用戊巴比妥钠麻醉小鼠后，用生理盐水和 4%                         恢复。
   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48