Page 62 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第8期
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             （AP：-2.0，ML：-1.5，DV：-1.5）或梨状皮层（AP：2.2，             录的膜电位为细胞静息电位（RMP）。
              ML：-2.0，DV：-4.5），注射完成后留针10 min。缓慢                 1.3  统计学方法
              拔针并完成缝合。                                               应用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，符合
                  梨状皮层使用剂量为 0.1 μg、0.2 μg 和 0.4 μg，             正态分布的计量资料，两组比较采用t检验；多组比
              分别立体定位注射 200 nL KA（0.5 mg/mL）、200 nL              较采用单因素方差分析或者双因素方差分析。P＜
              KA（1 mg/mL）和200 nL KA（2 mg/mL）。                   0.05 为差异有统计学意义。
              1.2.4 行为学方法
                                                                2  结 果
              1.2.4.1 水迷宫
                  前4 d为训练期，分别从水迷宫4个象限将小鼠                        2.1  腹腔注射KA的急性癫痫模型中梨状皮层和海
              依次放入。每次训练时间为 1 min，1 min 内找到平                     马脑区被激活
              台，使其在平台上停留15 s。若1 min内未找到平台                            利用经典急性癫痫小鼠模型寻找癫痫相关脑
              则引导小鼠到达平台并停留 15 s。第 5 天为测试                        区。在小鼠腹腔注射15 mg/kg KA 2 h 后灌注取脑，
              期，撤掉平台，将小鼠从第二象限放入，记录第一次                           冰冻切片后进行c⁃fos免疫荧光染色。结果显示，小
              到达平台的时间和到达总次数等信息。                                 鼠大脑梨状皮层和海马区域内神经元被大量激活
              1.2.4.2 新物体识别                                     （图1A），c⁃fos阳性细胞数量显著增加（P < 0.001，图
                  第一阶段，在实验装置里放入两个相同物品，                          1B），与海马相比无显著性差异。结果表明，在腹腔
              并让小鼠自由探索 10 min。第二阶段，与第一阶段                        注射 KA 的急性癫痫模型中，梨状皮层和海马脑区
              间隔1 h以上，将其中一个物品换成新物品，再次放                          一样，神经元会被大量激活。
              入测试小鼠，让其自由探索10 min，完成测试。更换                        2.2  腹腔注射KA的急性癫痫模型中梨状皮层和海
              测试小鼠之前，用75%酒精擦拭实验装置。                              马脑区神经元发生凋亡
              1.2.5 电生理记录                                            已有研究显示，在 KA 的刺激下神经元过度激
                  对照组和处理组小鼠分别使用异氟烷麻醉后，                          活会对大脑有进一步损伤，造成细胞凋亡                    ［19］ 。利用
              使用 20 mL 冰冻记录用人工脑脊液（ASCF）灌注小                      TUNEL检测技术，对急性癫痫小鼠模型的梨状皮层
              鼠。使用大剪刀迅速断头，取出鼠脑，剥离至预充                            和海马脑区进行凋亡检测（图 2A），结果显示，在急
              氧（95%O2+5%CO2 ）的高糖 ASCF 中。2 min 后取出               性癫痫模型小鼠中梨状皮层和海马脑区的神经元
              鼠脑修块，并转移固定到震荡切片机的载脑台上并                            凋亡数量与对照组相比显著增多（P < 0.001，图
              一起置于切片机的切片槽中，调节刀片角度，迅速                            2B）。与海马区域相比，梨状皮层神经元凋亡数量
              将鼠脑切成 250 μm 厚脑片。用吸管将切好的脑片                        也显著增多（图 2B）。这表明梨状皮层和海马脑区
              转移至预充氧的32 ℃ ASCF中，孵育30 min，然后再                    的神经元在急性癫痫小鼠模型中都发生凋亡，且梨
              转移至室温，稳定至少1 h后开始记录。                               状皮层神经元凋亡数量比海马显著增多。
                  吸管将孵育好的小鼠脑片转移到充满ASCF的                         2.3  梨状皮层脑立体定位注射KA的最佳剂量
              脑片槽中，用缠有尼龙丝的铂金圏压住脑片。采用                                 上述结果表明除海马外，梨状皮层神经元在急
              全细胞膜片钳的方法来记录膜电位和电流诱发的                             性癫痫模型中也被大量激活，海马立体定位注射
              动作电位。玻璃电极灌入电极内液后给予正压，接                            KA的癫痫模型已被广泛应用，于是将KA分别定位
              近细胞后释放正压并用嘴短促地吸气，给予细胞                             注射到小鼠梨状皮层。参考海马立体定位注射KA

              负压，同时用 Multi Clamp700B 迅速将细胞钳制到-                  的癫痫模型使用1 nmol（约0.213 μg）KA 剂量            ［20］ ，在
              70 mV，等待电极与细胞间形成高阻封接（>1 GΩ）。                      梨状皮层探索了0.1 μg、0.2 μg和0.4 μg 3种使用剂

              使用 Zap 方式进行破膜，观察破膜后串联电阻 Ra                        量，立体定位注射后观察小鼠行为。对小鼠痫性发
             （<30 MΩ）和漏电流（<-100 pA）的值。对于良好破膜                    作强度进行惊厥分级，分级标准采用Racine 分级方

              的细胞进行全细胞膜片钳记录。在电流钳模式下，I=                          法：0 级，行为正常；Ⅰ级，动须、眼，湿狗样抖动，节
              0时给予细胞不同电流刺激（步阶，-200 pA+Δ50 pA）                   律性咀嚼；Ⅱ级，点头，甩尾；Ⅲ级，一侧前肢阵挛；
              以诱发动作电位，刺激时间为 500 ms，2 次 trial 间隔                 Ⅳ级，双侧前肢阵挛，站立；Ⅴ级，全身阵挛，跌倒。
              为5 s。全细胞记录过程中，观察和记录Ra值，变动                         其中 Racine Ⅰ~Ⅲ级行为代表了部分点燃，Racine
              范围超过25%的细胞去除。刺激电流为0 pA时，记                         Ⅳ、Ⅴ级行为代表完全点燃。结果显示KA 0.1 μg组
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