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第43卷第8期               张玲芝，秦 滢，吴连连，待. 梨状皮层注射红藻氨酸建立癫痫小鼠模型［J］.
                  2023年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1094-1101                      ·1095 ·


                    癫痫是一种慢性神经系统疾病，其病理特征是
                                                                  1  材料和方法
                神经元过度或超同步放电 。全球 1%~2% 的人患
                                       ［1］
                有癫痫并影响着全球 10% 人口的正常生活 。其                          1.1  材料
                                                       ［2］
                反复无端发作使患者备受煎熬，给患者及其家人                                 8周龄C57BL/6雄鼠，体重20~25 g，由徐州医科
                造成了很大困扰。目前癫痫的发病机制暂不明                              大学实验动物中心提供。随机分为腹腔注射生理
                确，但普遍认为是神经元异常放电引起的大脑暂                             盐水对照组（4只）、腹腔注射15 mg/kg KA 组（KA组，
                时性生理功能障碍 。内侧颞叶癫痫是成人中最                             4只）、海马注射KA模型组（Hi⁃KA组，5只）、海马注
                                 ［3］
                常见的癫痫类型 ，据报道，颞叶癫痫患者会发生                            射生理盐水对照组（Hi⁃Con组5 只）、梨状皮层注射
                               ［4］
                许多病变，包括海马硬化、细胞死亡 、颗粒细胞                            KA 模型组（Pir⁃KA 组，30 只）和梨状皮层注射生理
                                                 ［5］
                    ［6］
                分散 和神经胶质增生等。为了模拟颞叶癫痫，研                            盐水对照组（Pir⁃Con组，10只）。本研究经徐州医科
                究学者们已经开发了几种癫痫实验模型，包括毛                             大学伦理批准，实验伦理号：202207S128。

                果芸香碱模型、电点燃模型和红藻氨酸（kainic ac⁃                          KA（K2389，Sigma 公 司 ，美 国），c ⁃ fos 抗 体
                id，KA）模型等，其中 KA 癫痫模型被广泛应用于科                      （2250，Cell Signaling Technology 公司，美国），DAPI
                学研究。                                              染 色 液（C1005，上 海 碧 云 天），TUNEL 试 剂 盒
                    KA 是一种高亲和力激动剂，主要由红藻氨酸                        （11684795910，罗 氏 公 司 ，美 国），荧 光 显 微 镜

                受体的激活发挥作用。KA 受体与 AMPA 受体（α⁃                      （BX53/DP73，Olympus 公司，日本），脑立体定位仪、
                amino⁃3⁃hydroxy⁃5⁃methyl⁃4⁃isoxazole⁃propionic acid  台式动物手术显微镜（深圳瑞沃德公司），冰冻切片
                receptor，α⁃氨基⁃3⁃羟基⁃5⁃甲基⁃4⁃异恶唑丙酸受                  机（Leica 公司，德国），微量移液器（Gilson 公司，法
                体）和 NMDA 受体（N⁃methyl⁃D⁃aspartic acid recep⁃       国），膜片钳放大器（MultiClamp700B，Axon 公司，美
                tor，N⁃甲基⁃D⁃天冬氨酸受体）一起构成谷氨酸受                        国），数据采集器（Digidata 1400A，Molecular Devices
                体的离子型受体家族。天然红藻氨酸受体广泛                              公司，美国），微操纵器（MPC⁃200，Scientifica 公司，
                            ［7］
                分布在大脑中 ，且在海马区域较为密集。1970 年                         英国），硼硅酸玻璃电极（1.2 mm 外径，0.69 mm 内
                以来，海马就被认为是与癫痫发作相关的区域 。                            径）、P97微电极拉制仪拉制（Sutter Instrument 公司，
                                                           ［8］
                研究人员将 KA 注射到海马中，发现胶质增生                      ［9］   美国）
                和细胞凋亡等病理变化，其发病特征也与在人类                             1.2  方法
                颞叶癫痫患者中观察到的相似                ［10］ 。因为它能模          1.2.1 c⁃fos免疫荧光染色
                拟在单侧海马发生硬化的颞叶癫痫病例且死亡                                  小鼠腹腔注射15 mg/kg KA约2 h后，经4%多聚
                率低  ［11］ ，所以海马内给予 KA 诱导的自发性癫痫                     甲醛灌注固定，取脑，固定过夜，经30%蔗糖脱水沉
                小鼠模型被科研界广泛应用，成为较成熟的癫痫                             糖。冰冻切片，切片厚25 μm，10%山羊血清封闭于
                模型  ［12］ 。                                        37 ℃烘箱 40 min，滴加 c⁃fos 抗体（1∶500），4 ℃孵
                    梨状皮层与海马结构相似，具有保守发育的                           育过夜。PBS 清洗 3 次，10 min/次，滴加荧光二抗
                三层结构，与边缘和皮层区域有广泛的联系，且                            （1∶500）孵育 1.5 h；PBS 清洗 3 次，10 min/次，DAPI
                拥有与海马体中类似的微电路，提供兴奋、前馈                             染色10 min；PBS清洗3次，10 min/次，加防荧光淬灭
                抑制和反馈抑制         ［13-14］ 。容易受到兴奋性毒性损               剂封片并于荧光显微镜下观察拍照。
                伤，并且与癫痫发作有关            ［15］ 。早在 1993 年研究显         1.2.2 TUNEL染色
                示，在癫痫模型中，海马、杏仁核、嗅球、梨状皮质                               冰冻切片25 μm 充分晾干，PBS漂洗2次；玻片

                和内嗅皮质中检测到 c⁃fos 信使 RNA（messenger                  干后，加 50 μL TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅
                RNA，mRNA）表达显著增加           ［16］ 。后续研究表明，           加50 μL 2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗
                电刺激梨状皮层也可以产生抗癫痫作用                      ［17］ 。但    湿盒中反应 37 ℃ 1 h。PBS 漂洗 3 次后加 1 滴 PBS
                是在人类癫痫研究中，人们大多关注内侧颞叶结                             在荧光显微镜下拍摄。
                构，尤其是海马       ［18］ ，而梨状皮层在癫痫研究中未                  1.2.3 模型建立方法
                得到重视。                                                 小鼠麻醉后固定于立体定位仪上，剪开头皮、
                    本研究通过与海马注射 KA 癫痫模型对比，探                        暴露颅骨，利用前、后囟调平颅骨，利用玻璃电极连
                讨梨状皮层注射KA癫痫模型的可行性及优势。                             接微量注射器将 200 nL KA（1 mg/mL）注射于海马
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