Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第8期
               ·1042 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年8月


                ［4］
              点 。囊泡分选蛋白 13（vacuolar protein sorting 13，         养基。待3T3⁃L1细胞生长密度达到80%~90%后，将
              VPS13）是新鉴定出来的脂质转运蛋白，其在进化                          细胞传代到 3.5 cm 细胞培养皿中，继续在培养箱
              上相对保守。该蛋白首先在酵母中被发现，但在                             （37 ℃、5% CO2 ）中 培 养 ，待 细 胞 生 长 密 度 达 到
                                                         ［5］
              人类中有 4 种与其同源的基因（VPS13A⁃D） 。                       100%，继续让细胞接触抑制2 d，于第3 天更换新的
              VPS13 基因的突变与遗传性疾病具有密切关系：                          分化培养液Ⅰ（含0.5 mmol/L 3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌
              VPS13A 被报道与舞蹈棘细胞增多症密切相关；                          呤、5.0 μmol/L地塞米松、1.0 μmol/L罗格列酮、1.0 μg/L
              VPS13B 突变可导致科恩综合征，该疾病的特征是                         胰岛素和10%胎牛血清），在分化液Ⅰ中分化2 d，再
              整体发育迟缓和智力残疾；VPS13C 则与早发型的                         换上分化培养液Ⅱ（含 1 μg/L 胰岛素和 10%胎牛血
              帕金森病相关；VPS13D 突变会伴有痉挛状态的共                         清）继续在分化培养液Ⅱ中分化6 d，隔天换新鲜的高
              济失调。因此研究 VPS13 的亚细胞定位及其分子                         糖培养基。
              功能将有助于揭示这些疾病的发病机制。                                1.2.2 慢病毒感染和单克隆细胞筛选
                  研究表明，VPS13A定位于内质网⁃线粒体和内质                           将 HEK293T 细胞于 6 cm 培养皿中培养，等细
                             ［6］
              网⁃脂滴接触部位 ，是内质网和其他细胞器之间的脂                          胞密度达到 70%~80%时，用 lipofectamine2000 将三
                        ［7］
              质转运蛋白 。VPS13A敲降后人胚肺细胞内的脂滴                         质粒（lentiCRISPRv2、psPAX2、pMD2.G）共同转染进
              增多 ，目前关于VPS13A在脂肪细胞中的作用还没                         人 胚 胎 肾 细 胞 293（human embryonic kidney 293
                  ［8］
              有相关研究报道，本研究旨在观察VPS13A在3T3⁃L1                      cells，HEK293T）细胞进行病毒的包装，小向导核糖
              细胞分化过程中的表达情况以及敲降VPS13A对脂                          核酸（small guide ribonucleic acid，sgRNA），sgRNA⁃
              肪前体细胞3T3⁃L1分化和脂代谢的影响。                             VPS13A oligo 的序列为：sgRNA⁃VPS13A 上游引物
                                                                5′⁃CACCGTGACCAACTTTAACTTTGAA⁃3′，下游引
              1  材料和方法
                                                                物 5′⁃AAACTTCAAAGTTAAAGTTGGTCAC⁃3′，转染
              1.1  材料                                           6 h后给细胞换液，分别收集48 h和72 h含慢病毒的
                  3T3⁃L1 细胞由南京医科大学韩晓教授惠赠；                       培养基。4 500 g 离心 20 min 取上清，0.22 μm 滤器
              VPS13A 抗体（武汉爱博泰克公司）；过氧化物酶体                        过滤，分装后放-80 ℃保存。感染病毒前一晚将3T3⁃
              增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated        L1 接种到 6 孔板（感染前密度达到 50%左右），将病
              receptorg，PPARγ）抗体、转录共激活因子CCAAT/增                 毒上清与培养基于EP管1∶1混匀，并加入Polybrene（终
              强子结合蛋白α（CCAAT/Enhancer binding protein al⁃        浓度：8 mg/mL），缓慢加入孔板中。预先留 2 个未感
              pha，C/EBPα）抗体、转录共激活因子CCAAT/增强子                    染病毒的孔作为空白对照。感染24 h后换液，感染
              结合蛋白β（CCAAT/Enhancer binding protein β，C/         48 h 后，换含有 2 μg/mL 嘌呤霉素的培养基进行筛
              EBPβ）抗体（Santa Cruz 公司，美国）；Calnexin 抗体             选。3 d 后，观察空白对照组细胞基本死亡，继续培
             （Stressgen 公司，加拿大）；蛋白 marker（Bio⁃Rad 公             养实验组细胞，Western blot验证敲降效率。
              司，美国）；油酸、油红（Sigma⁃Aldrich 公司，美国）；                      单克隆细胞筛选：细胞计数，将细胞以每孔1个
              TRIzol Reagent 总 RNA 提取剂、胰岛素（Invitrogen 公         细胞的密度种到96孔板中，细胞贴壁后镜下观察单
              司，美国）；3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤、地塞米松、罗格列                      个细胞的孔，并做标记。96孔板中单个细胞长成细
              酮（MCE 公司，美国）；SYBR Green Ⅰ（SYBR Green              胞团后，胰酶消化后接种到 24 孔板。以此类推，细
              qPCR Master Mix）（南京诺唯赞）；胎牛血清、小牛血清                 胞长满后依次种到 12 孔板、6 孔板，Western blot 验
             （Gibco公司，美国）；3.5 cm皿和6孔板（Corning公司，                证敲降效率。
              美国）；引物由上海捷瑞基因有限公司合成；氟硼二吡                          1.2.3 RNA提取及相对定量水平检测
              咯化合物（4，4⁃difluoro⁃boradiazaindacene，BODIPY）、           3.5 cm细胞培养皿中加入0.5 mL TRIzol将细胞

              逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis       裂解，将红色液体转移到新的EP管中。在裂解液中
              Kit（Thermo Fisher公司，美国）。                          加入 200 μL 氯仿，轻微涡旋 15 s，22 ℃静置 5 min，

              1.2  方法                                           将其于 4 ℃ 12 000 g 离心 30 min，分离水相层；再
              1.2.1 3T3⁃L1细胞培养、分化                               将上层含 RNA 的液体转移到新的离心管，再加入
                  3T3⁃L1细胞置于高糖培养基（含10%小牛血清）                     500 μL 预冷的异丙醇沉淀 RNA，轻轻混匀，22 ℃静
              中于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天需更换新鲜培                      置15 min。在4 ℃离心机中10 000 g离心15 min，保
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