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第43卷第8期         刘   瑾，黄   昀，李超普，等. VPS13A在3T3⁃L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究［J］.
                  2023年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1041-1046                      ·1043 ·


                留底部的白色沉淀，将上层液体弃去，用 RNA 专用                         洗细胞，让细胞完全风干，再加入油红孵育10 min，之
                的75%乙醇洗涤沉淀，再次在4 ℃离心机中10 000 g                     后，弃去油红并用ddH2O洗4次，拍照。3T3⁃L1细胞
                离心5 min，使RNA重新沉淀，将乙醇弃去，待RNA自                      长至80%左右，更换含5 μg/mL BODIPY的培养基孵
                然风干。用含有焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，               育20 min，共聚焦显微镜观察脂滴大小和形态。
                DEPC）的 ddH2O 溶解。使用 Nana⁃Drop 仪器测量                 1.3  统计学方法
                RNA的浓度。利用两步法，将RNA逆转录为cDNA，                            所有计量数据均使用GraphPad Prism软件进行
                首先加入 DNA Eraser于42 ℃反应5 min去除基因组                  统计学分析。定量数据用均数±标准差（x ± s）表示，
                DNA，然后加入逆转录酶和底物于 37 ℃ 15 min、                     结果采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），P ≤
                85 ℃ 5 s反应生成所需的cDNA。逆转录的cDNA保                     0.05为差异有统计学意义。

                存于-20 ℃。将 cDNA 稀释 5 倍后，使用 LightCy⁃
                                                                  2  结 果
                cler480 型 Real⁃time PCR 仪进行 Q⁃PCR 反应，测定
                3T3⁃L1 细胞分化标志物以及 VPS13A 表达变化。                     2.1  VPS13A在3T3⁃L1细胞分化过程中表达升高
                反应程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃、15 s，60 ℃ 1 min，                收取分化不同天数的 3T3⁃L1 细胞，分别提取
                35 个循环，95 ℃ 10 s，60 ℃ continuous，40 ℃ 20 min。     RNA 及蛋白分析分化相关的标志分子 PPARγ、

                目的基因和内参引物如下：VPS13A 上游引物 5′⁃                       CEBPα和 VPS13A 的表达水平，Q⁃PCR 检测脂肪细
                CACCAGTGCTATGGCTAA⁃3′，下游引物 5′⁃GTAA⁃               胞分化相关标志蛋白的转录水平。结果表明，随着
                CAATCCCTGTAATGC⁃3′；CEBPα上游引物 5′⁃GCG⁃              脂肪细胞分化，PPARγ和 CEBPα表达逐渐升高，
                CAAGAGCCGAGATAAAG⁃3′，下游引物 5′⁃CGGT⁃                VPS13A的表达在分化前期下降，而在分化的后期逐
                CATTGTCACTGGTCAACT⁃3′；CEBPβ上游引物 5′⁃               渐升高（图1A）。蛋白水平上进一步证明随着分化过
                CGCCTTTAGACCCATGGAAG⁃3′，下游引物 5′⁃CCC⁃              程的进行，PPARγ和 CEBPα蛋白水平升高，VPS13A
                GTAGGCCAGGCAGT⁃3′；PPARγ上游引物 5′⁃CA⁃                蛋白在分化前期下降，在后期逐渐升高（图1B）。以
                CAATGCCATCAGGTTTGG⁃3′，下游引物 5′⁃GCTG⁃               上结果提示VPS13A在3T3⁃L1细胞分化过程中受细
                GTCGATATCACTGGAGATC⁃3′；内参基因36B4上游                 胞分化状态的调节并具有一定的生理功能。
                引物 5′⁃CACTGGTCTAGGACCCGAGAAG⁃3′，下游                2.2  构建VPS13A稳定敲降的3T3⁃L1细胞系
                引物5′⁃GGTGCCTCTGGAGATTTTCG⁃3′。                         本研究采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术沉默
                1.2.4 免疫印迹法                                       3T3⁃L1 细胞中的 VPS13A 基因表达，其优势主要在
                    3.5 cm细胞培养皿加入70 μL细胞裂解液，裂解                    于目的基因能够以高效率整合到基因组中，慢病毒
                细胞10 min，转移至新的离心管中，于4 ℃ 12 000 g离                 感染时，三元载体共转染包装 HEK293T 细胞后，收
                心 30 min，将上层的澄清蛋白液转到新的离心管。                        集含病毒的培养基感染靶细胞3T3⁃L1，以构建稳定
                将蛋白原液用ddH2O稀释50倍，将BCA蛋白浓度试                        敲降VPS13A的细胞系。Q⁃PCR及Western blot验证
                剂盒中的A液与B液以100∶2的比例混匀，将稀释的                         基因敲降效果，结果表明 VPS13A 基因的表达被沉
                蛋白液10 μL与反应液100 μL混匀，加到96孔板，避                     默（图2）。
                光37 ℃条件下反应30 min，之后再用酶标仪测量吸                       2.3 将3T3⁃L1细胞诱导分化为成熟脂肪细胞
                光度，根据吸光度的结果计算出蛋白液浓度。在蛋                                为了探究 VPS13A 对脂肪细胞的分化影响，对
                白原液加入 5×的 SDS，于 37 ℃水浴 60 min 使蛋白                 敲降 VPS13A 后的细胞及对照组细胞进行诱导分
                变性。定量后的蛋白进行 SDS⁃PAGE 电泳，将电泳                       化。首先将3T3⁃L1细胞培养至密度达到80%~90%
                后的蛋白转移到 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉溶液                        后，将细胞传代到3.5 cm细胞培养皿中，等细胞长满
                于室温条件下封闭1~2 h，于4 ℃冰箱孵育抗体过夜，                       至100%并且继续让细胞接触抑制达到2 d后再更换
                TBST洗膜30 min，用对应的二抗孵育1~2 h，TBST 洗                 新的分化培养液Ⅰ（含DMEM高糖培养基、0.5 mmol/L
                膜 30 min，ECL 化学发光法检测目的蛋白表达。                       3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤、5.0 μmol/L 地塞米松、
                1.2.5 油红和BODIPY染脂滴                                1.0 μmol/L罗格列酮、1.0 μg/L胰岛素和10%胎牛血
                    脂肪细胞分化成熟后，弃去培养基，加 10%福                        清），培养 2 d，再换上分化培养液Ⅱ（含 1 μg/L 胰岛
                尔马林处理5 min，弃去后再加入同体积的10%福尔                        素和 10%胎牛血清）继续培养 6 d，之后用光学显微
                马林孵育1 h，之后弃去福尔马林，用60%的异丙醇清                        镜对细胞进行观察和拍摄。发现对 3T3⁃L1 细胞进
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