Page 14 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 14

第43卷第8期
               ·1048 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年8月


              cognitive impairment） 。但是直至目前，机体代谢                和二氧化碳产生等测量小鼠代谢性能；红外光束框架
                                ［1］
              紊乱与认知功能障碍之间的发病机制尚不明确。                             测量小鼠身体活动量）适应48 h后开始记录数据。正
                  大量研究证实，慢性应激是老年人代谢紊乱和                          式实验为一昼夜，记录小鼠的体质量、摄食量、饮水
              认知功能下降的重要原因             ［2-3］ 。作为人体重要的应           量、身体活动量、氧气消耗（VO2 ）、二氧化碳产生
              激激素——糖皮质激素已被证实和肥胖、认知功能                            （VCO2 ）及整体产热并利用曲线图展示。
              密切相关。临床上，不管是内源性分泌过多的糖皮                            1.2.3 Morris水迷宫检测
              质激素还是长期使用外源性糖皮质激素，都会导致                                 使用一个由经圆点划分为4个象限的圆形水池，
                                                         ［4］
              严重的代谢紊乱，同时也造成认知功能的下降 。                            靶象限区域有一低于水平面1 cm的深色圆柱状小平
              11β⁃羟化类固醇脱氢酶 1（11β⁃hydroxysteroid dehy⁃           台，水温（22±2）℃。实验包括为期4 d的训练阶段和
              drogenase type 1，11β⁃HSD1）是调控局部组织糖皮质              为期1 d的检测阶段，每个象限训练1次，每天按水池
              激素活性的关键酶，它将无活性的可的松转化为有                            顺时针方向依次训练4个象限。摄像头记录和分析
              活性的氢化可的松，是糖皮质激素在局部组织的功                            小鼠找到平台的时间、轨迹图等。使用ANY⁃MAZE
              能放大器    ［5-6］ 。既往研究发现，11β⁃HSD1 显著调控               软件，对实验动物跟踪研究，评估对空间记忆的功能。
              脂肪组织功能和机体代谢紊乱，使用 11β⁃HSD1 抑                       1.2.4 Y迷宫
              制剂可以明显减少肥胖小鼠的白色脂肪含量、上调                                 使用一个聚氯乙烯板制成的呈字母Y型的三臂
              其棕色脂肪的功能         ［7-8］ ，改善小鼠的糖代谢。但是，              迷宫（8 cm×30 cm×15 cm），随机定义为：起始臂、新
              11β⁃HSD1对认知功能的影响仍不清楚。                             奇臂和其他臂。实验包含训练期和测试期，间隔2 h
                  线粒体是细胞能量的“发电厂”，是大脑能量代                         进行。训练期将新奇臂用活动挡板挡住，让小鼠探
              谢的动力保障。有研究显示，神经退行性疾病如帕                            索起始臂和其他臂；检测期将挡板移除，小鼠自由
              金森病和痴呆患者的外周血线粒体 DNA 拷贝数显                          探索 3 个臂。摄像头记录和分析测试期时小鼠在 3
              著下降 ，相反，改善大脑的线粒体能量代谢则可以                           个臂探索时的情况。通过使用ANY⁃MAZE软件，评
                    ［9］
              有效逆转认知障碍。因此，本课题组在构建 11β⁃                          估小鼠对新异环境的识别记忆能力。
              HSD1 全身基因敲除小鼠的基础上，深入研究 11β⁃                       1.2.5 旷场实验
              HSD1对长期高脂饮食状态下整体代谢和认知功能                                使用一个底部被等分为 25 个正方形小格的正
              的影响，探讨 11β⁃HSD1 影响认知功能的机制，为老                      方体实验箱（45 cm×45 cm×45 cm），中间9个格子命
              年认知功能障碍提供有效的治疗靶点。                                 名为中央区域。将小鼠放置旷场正中格后立即进
                                                                行实验记录共 5 min。摄像头记录和分析小鼠在旷
              1  材料和方法
                                                                场探索时的情况，通过ANY⁃MAZE软件，评价实验动
              1.1  材料                                           物在新异环境中自主行为、学习探究行为与紧张度。
                  以 C57BL/6J 为遗传背景的野生对照组及 11β⁃                  1.2.6 肌肉力量测定
              HSD1 基因敲除组小鼠，繁殖于南京大学模式动物                               使用小鼠抓力测定仪（KW⁃ZL⁃1，南京卡尔文生
              研究所，每组各15只，4周，雄性，高脂饮食20周，饲                        物科技有限公司），对小鼠进行肌肉力量测定，从笼
              养在SPF级动物房。                                        中取出小鼠，将小鼠轻轻放在抓力板上，抓住小鼠
              1.2  方法                                           尾端轻轻向后拉，以免对小鼠造成惊吓或产生误
              1.2.1 葡萄糖耐量实验及胰岛素耐量实验                             差。待小鼠抓牢抓力板后，拉住其尾部，均匀使用
                  葡萄糖耐量实验将小鼠禁食15 h，正常饮水，腹                       力量向后拉，直到作用力致使小鼠的爪子松开抓力
              腔注射葡萄糖（1.5 g/kg），剪尾取血，使用血糖仪分                      板，这样可以测得小鼠最大抓力。按照以上方法重
              别测定 0、15、30、45、60、120 min 血糖。胰岛素耐量                复5次，得出平均抓力。
              实验将小鼠禁食4 h，正常饮水，腹腔注射胰岛素（优                         1.2.7 透射电镜检测
              泌林，1 U/kg）溶液，剪尾取血，使用血糖仪分别测定                            分离出小鼠海马体组织，放入2.5%戊二醛中固
              0、15、30、45、60、120 min血糖。                          定 2 h，将海马组织样本修饰成 1 mm 小块，丙酮梯
                                                                                                  3
              1.2.2 TSE标准代谢笼                                    度脱水、包埋、半薄切片处理后甲苯胺蓝染色，倒置
                  提前在无偏差无应激的标准代谢笼（高精度传感                         光镜定位后制作超薄切片，经醋酸双氧铀、枸椽酸
              器测量小鼠饮水和摄食行为；由产生热量、氧气消耗                           铅双染色，透射电镜 5 000~40 000 倍观察小鼠海马
   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19