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第44卷第1期 曹晓蓉，林倩楠，王慧艳，等. 妊娠期糖尿病胎盘滋养细胞铁死亡超微结构及铁死亡相关基
2024年1月 因ACSL4、GPX4的表达［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（01）：017-023 · 19 ·

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3 000 mg 。其中，二甲双胍治疗效果不佳需联用胰 胺凝胶电泳分离蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯
岛素者予以剔除。选用胰岛素治疗组予超短效胰 膜，5%脱脂奶粉封闭，加入ACSL4抗体（1∶1 000）和
岛素餐前皮下注射，必要时联合长效胰岛素睡前注 GPX4抗体（1∶1 000），以GAPDH为内参，4 ℃孵育过
射，初始剂量 0.3~0.8 U/（kg·d），根据孕期病情进展 夜。使用 TBST 缓冲液冲洗 3 次，每次 5 min。随后
及血糖情况及时调整。 加入相应二抗孵育 1 h，洗膜后显色，应用 Bio⁃Rad
1.2.2 主要试剂 Gel Doc EZ 凝胶成像系统和 Image J 软件分析目标
2.5%戊二醛固定液购自福州飞净生物科技公 条带的灰度值。
司，普鲁士蓝染色试剂购自索莱宝公司，长链脂酰 1.2.8 qRT⁃PCR

辅酶A合成酶4（acyl⁃CoA synthetase long chain family 应用 TRizol 试剂盒提取胎盘组织中的总 RNA，
member 4，ACSL4）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione 通过紫外分光光度计测定 RNA 的浓度和纯度。通
peroxidase 4，GPX4）抗体购自美国Abcam公司，内参 过荧光定量 PCR 系统和 SYBR Green 试剂盒进行

GAPDH 抗体购自上海碧云天生物技术公司，cDNA qRT ⁃ PCR。 引 物 序 列 如 下 ：ACSL4，上 游 5′ ⁃
第一链合成试剂盒购自日本TaKaRa公司。 ATACCTGGACTGGGACCGAA⁃3′，下游 5′⁃TGCTG⁃
1.2.3 样本采集 GACTGGTCAGAGAGT⁃3′。GPX4，上游 5′⁃CAGT⁃
新鲜胎盘分娩后，3 min 内避开出血、钙化等区 GAGGCAAGACCGAAGT ⁃ 3′ ，下 游 5′ ⁃CCGAACTG⁃
域，尽快在胎盘母体面用无菌剪切出厚度适中的胎 GTTACACGGGAA⁃3′。反应条件如下：95 ℃预变性
盘组织 5 片（约 2 cm×2 cm×2 cm），无菌盐水冲洗干 10 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45 个循环，
净。2 片置于 10%福尔马林溶液固定后，石蜡包 最后 72 ℃延伸 5 min。GAPDH 作为内参基因。通
埋。2片浸于RNAlater 保存液置于EP管中，编号后 过2 -△△Ct 法计算基因的相对表达量。
冻存于-80 ℃冰箱。将最后 1 片分成 1 mm×1 mm× 1.3 统计学方法
1 mm 大小的组织，新鲜置入预冷 2.5%戊二醛固定 使用统计软件 SPSS 27.0 进行数据分析。计量
液中，4 ℃冰箱避光储存。 资料均用均数±标准差（x ± s）表示。样本均数比较
1.2.4 透射电镜观察胎盘滋养细胞 采用One⁃way ANOVA检验，组间比较方差齐时采用
新鲜胎盘置入 2.5%戊二醛固定液浸泡，1%锇 LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验，P < 0.05
酸室温固定2 h，乙醇梯度脱水，每次15 min。100% 为差异有统计学意义。
丙酮置换 3 次，树脂包埋固化、切片，3%醋酸铀、柠
2 结 果
檬酸铅双重染色，漂洗后在透射电镜下观察和拍摄
细胞形态。 2.1 一般情况及妊娠结局比较
1.2.5 普鲁士蓝染色 比较5组孕妇的年龄、孕周、孕次、产次，差异均
石蜡切片按常规方法烘烤、脱蜡和水化，然后 无统计学意义（P > 0.05）。G1、G2、G3组孕前体重指
普鲁士蓝入染色工作液浸染30 min。水洗后入核固 数（body mass index，BMI）高于N组（P < 0.05），G3组
红染色液，染细胞核 5 min 后水洗。然后常规方法 孕前 BMI 高于 G1 组（P < 0.05），G2、G3 组孕前 BMI
乙醇脱水、二甲苯透明、封片，最后中性树胶固封， 高于 G4 组（P < 0.05）。N 组、G1 组新生儿体重低于
于显微镜下观察并拍照。 G4组（P < 0.05），5组均未发生新生儿窒息（表1）。
1.2.6 免疫组化 2.2 胎盘滋养细胞超微结构
将切片常规脱蜡、水化、高温修复，用 1%过氧 电镜下，N 组胎盘滋养细胞线粒体结构基本正
化氢溶液封闭内源性过氧化物酶。ACSL4、GPX4抗 常，未见明显线粒体皱缩及嵴断裂，而 G1、G2、G3、
体（1∶500）滴入切片后 4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液洗 G4组GDM胎盘滋养细胞中线粒体萎缩、变小，膜密
涤，结合二抗，滴加 SABC 溶液孵育显色，显微镜下 度增加，线粒体变圆，嵴加深，其中G4组最为严重，
观察见棕褐色颗粒视为显色完成，放入水中停止显 高度符合铁死亡细胞的特征。而饮食治疗的 G1 组
色，脱水封片。 线粒体改变程度最轻，其次是口服二甲双胍治疗的
1.2.7 Western blot G2组（图1）。
提取每组胎盘组织中的蛋白质，使用BCA蛋白 2.3 胎盘普鲁士蓝染色结果
定量试剂盒测量蛋白质浓度。通过 10%聚丙烯酰 使用普鲁士蓝染色，铁被染成蓝色，细胞质呈