Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第1期
· 26 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年1月
市第二人民医院提供。所有标准菌株保存于-80 ℃ 100 μL Tris⁃EDTA 中,100 ℃加热煮沸 10 min,释放
超低温冰箱,使用前于35 ℃微生物培养箱活化。为 基因组DNA。
验证RPA⁃LFS技术对临床标本的适用性,于2022年 1.2.2 引物设计及RPA反应
1—12 月收集 108 例临床检验样本,其中 57 例来自 在美国国家生物技术信息中心网站(https://
痰液,30例来自尿液,21例来自血液。 www.ncbi.nlm.nih.gov)检 索 SMA 特 异 性 序 列 NC_
010943.1。使用 Primer premier 5 软件设计引物对,
表1 本研究所用标准菌株 由通用生物有限公司(中国)合成。引物设计原则
Table 1 Standard strains used in this study
如下:引物长度 30~35 bp;GC 含量 30%~70%;扩增
Strains ID Number
子长度 100~500 bp;最大单核苷酸重复长度为 5。
SMA ATCC 17666
使用基础型 RPA 试剂盒筛选最佳引物对。RPA 反
Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 应体系共 50 μL,向含有酶组分的反应管中加入
Staphylococcus aureus ATCC 43300 29.4 μL 反应缓冲液、2.4 μL 10 μmol/L 上游引物
Escherichia coli ATCC 8739 (F)、2.4 μL 10 μmol/L下游引物(R)、13.3 μL基因组
Enterococcus faecalis ATCC 29212 模板和2.5 μL 280 nmol/L醋酸镁溶液。上下颠倒充
Enterococcus faecalis ATCC 700221 分混匀反应管内溶液,瞬时离心。将反应管置于
Acinetobacter baumannii ATCC 19606
37 ℃水浴锅孵育30 min。RPA 反应完成后,使用等
Haemophilus influenzae ATCC 49247
体积的苯酚⁃氯仿⁃异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692
RPA扩增产物。12 000 r/min离心5 min,取上清,加
Klebsiella Pneumoniae ATCC 00603
入适量 DNA 上样缓冲液,通过 2%琼脂糖凝胶电泳
Candida albicans ATCC 10231
Vibrio Parahaemolyticus ATCC 17802 分离(90 V,30 min),在紫外灯下观察RPA反应产物。
1.2.3 探针设计及RPA⁃LFS反应
1.1.2 主要仪器和试剂 根据 RPA 反应筛选出最佳引物对后,将上游
微生物培养箱(上海 BluePard 公司),震荡培养 引物向3′端方向延长16 bp即为探针序列。探针的
箱(上海旻泉公司),超微量分光光度计(Quawell 公 5′端使用 FITC 标记,3′端使用 C3⁃间臂基团(3′⁃
司,美国),电热恒温水浴锅(上海精宏公司),电泳 Block)修饰,探针中部的一个碱基使用四氢呋喃
仪(Bio⁃Rad 公司,美国),全自动凝胶成像分析系统 (tetrahydrofuran,THF)取代,其中至少 30 bp 位于
(上海培清公司),细菌基因组提取试剂盒(北京天 THF位点的5′端,至少15 bp位于其3′端。下游引物
根公司),基础型RPA试剂盒、nfo型RPA试剂盒、侧 的 5′端使用生物素(Biotin)标记。RPA⁃LFS 反应体
向流动试纸条(常州安普未来公司)。 系共 50 μL,向含有酶组分的反应管中加入 29.4 μL
1.2 方法 反应液、2.1 μL 10 μmol/L上游引物、2.1 μL 10 μmol/L
1.2.1 微生物基因组提取 下游引物、0.6 μL 10 μmol/L探针、13.3 μL基因组模
将冻存的SMA接种于哥伦比亚血琼脂平板,置 板溶液和2.5 μL 280 μmol/L醋酸镁溶液。上下颠倒
于 35 ℃微生物培养箱培养 24 h。挑取培养皿上的 充分混匀反应管内溶液,瞬时离心。将反应管置于
单菌落,置于 5 mL Luria⁃Bertani 培养基中,在 35 ℃ 37 ℃水浴锅孵育 12 min。使用双蒸水将反应产物
振荡培养箱中震荡培养12 h。根据细菌基因组提取 稀释20倍,取50 μL稀释液滴加入试纸条的加样孔
试剂盒说明书提取 SMA 基因组 DNA,保存于-20 ℃ 中,等待显色。
备用。基因组 DNA 浓度使用超微量分光光度计定 1.2.4 特异度检验
量。其他标准菌株和临床分离的 SMA 使用加热煮 为检测RPA⁃LFS体系的特异度,使用该方法检
沸法提取DNA。菌株培养后,挑取菌苔置于100 μL 测了其他12种临床常见标准菌株和12株临床来源
Tris⁃EDTA 中,100 ℃加热煮沸 10 min,释放基因 的SMA,检测方法如前文所述。
组 DNA。基因组提取液冷却后,12 000 r/min 离心 1.2.5 灵敏度检验
5 min,取上清转移至无菌 EP 管,保存于-20 ℃备 使用双蒸水梯度稀释SMA基因组DNA(1×10 、
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用。用于RPA⁃LFS检测的临床样本,使用加热煮沸 1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、10 CFU/mL)用于检
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法粗提基因组。12 000 r/min 离心 5 min,沉淀溶于 测RPA⁃LFS 体系的灵敏度。取1 μL基因组DNA稀