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第44卷第1期 季 拓,高玉芝,王 彦,等. 重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽
2024年1月 窄食单胞菌方法的建立与应用[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2024,44(01):024-031 · 27 ·
释液加入 RPA⁃LFS 反应管中,补双蒸水至 13.3 μL, 样本个数+共同阴性样本个数)÷样品总数×100%,
使得每个反应分别含有 1×10 、1×10 、1×10 、10、1、 计算 RPA⁃LFS 法与另外两种方法的符合率,通过
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1×10 、1×10 CFU SMA的基因组,其余步骤如前文 kappa指数来评估该方法与其他方法的一致性。
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所述。每组浓度进行 10 次独立实验,通过对 10 个 1.3 统计学方法
独立实验的概率回归分析,确定该方法的最低检测 实验结果用 SPSS 13.0 软件分析。对临床检测
限(limit of detection,LOD),即 95%的概率检测出阳 数据进行 kappa 一致性检验,kappa 值 > 0.8 表示一
性产物的最低浓度。 致性较强,P < 0.05表明kappa值可靠。
1.2.6 临床标本检测
2 结 果
通过与生化培养法和qPCR检测法进行比较来
评估 RPA⁃LFS 法在临床标本检测中的实际应用价 2.1 引物和探针设计
值。用于生化培养法和qPCR检测法检测的临床样 根据 SMA 特异性基因序列 NC_010943.1 设计
本使用选择培养基进行培养,置于35 ℃微生物培养 出4组引物对(表2),对4组候选引物对进行基础型
箱培养 18~48 h。VITEK 2 全自动微生物分析系统 RPA反应(图2A)。4组引物对均产生了与预期大小
进行菌种鉴定。根据基因序列 NC_010943.1 设计 一致的靶向条带,分别为470、163、369、189 bp,但在
qPCR 引物 [16] ,按照操作流程对临床样本使用 qPCR 无模板对照(no template control,NTC)中出现了少量
法进行检测。qPCR 法步骤如下:95 ℃预变性 2 min 小于100 bp的引物二聚体条带。相比之下,引物对
后进入循环阶段,95 ℃变性 10 s,56 ℃退火 50 s, 1 具有较亮的目标条带,并且无肉眼可见的引物二
72 ℃延伸15 s,共40个循环。根据公式:(共同阳性 聚体。因此,选择引物对1用于探针的设计。
表2 RPA引物对序列
Table 2 RPA primer sequences
Primer pair Name Primer sequence(5′→3′) Primer length(bp) Product length(bp)
Set 1 SMA⁃F1 TGAACGAAGGCAAGATCCACGGCTACATCTG 31 470
SMA⁃R1 CTTGCCGTTGTATTCCATCGCCAGTTCTTC 30
Set 2 SMA⁃F2 CTACCCGAAGTTCCACGTCAGCCTGATGAA 30 163
SMA⁃R2 GCAGATGTAGCCGTGGATCTTGCCTTCGTT 30
Set 3 SMA⁃F3 CACTTCTGGACCAAGCACGGCAAGTTGAAC 30 369
SMA⁃R3 GATTGCAGTGACATGGCGTGTCTCCTACAC 30
Set 4 SMA⁃F4 GAGCGAACAGTCGTGGACGGTGATGAAGTT 30 189
SMA⁃R4 ATGCAGTTCTCTTCCTGGAAGTCGACGATG 30
F:Forward primer. R:Reverse primer.
根据引物对 1 的上游引物设计探针,修饰后的 的 3 个碱基不能替换;每条引物上替换的碱基不超
探针和引物见表 3,通过 RPA⁃LFS 检测引物探针组 过 5 个;不能有连续的 2 个碱基替换;优先使用 A⁃G
合 F1/R1/P1 的扩增性能及时确定是否存在假阳性 互换、T⁃C 互换。F1/R1/P1 引物⁃探针组合可产生
的情况。结果如图 2B 所示,F1/R1/P1 引物⁃探针组 的引物二聚体和碱基错配如图 2C 所示。当引入
合提供了正确的阳性信号(检测线和质控线上都 适当碱基错配后,无模板对照组的假阳性信号消失
有可见的红色条带),这表明 F1/R1/P1 引物⁃探针 (图 2B),后续实验使用F/R/P引物⁃探针组合。
组合具有良好的扩增性能。然而,在无模板对照组 2.2 RPA⁃LFS反应条件的优化
中,检测线上也显示出一条可见的弱化红带,表明 为实现RPA反应条件的最优化,对其反应时间
F1/R1/P1 引物探针组合存在假阳性扩增。考虑到 和温度进行了改良。控制反应温度为37 ℃,将反应
RPA反应环境下可能发生不利的引物相互作用,产 时间分别设置为0、2、4、6、8、10、12 min(图3A)。结
生较低分子量的DNA副产物(< 100 bp),即“引物噪 果显示,反应4 min时检测线出现颜色较弱的条带,
音”。为减少“引物噪音”的产生,本研究在引物中 在 8 min 时检测线条带清晰明亮。8 min 后,随着反
适当引入了碱基错配。错配原则如下:对具有 4 个 应时间的延长,检测线无明显变化。控制反应时
以上连续配对碱基的区域进行碱基错配;靠近3′端 间,分别在22、27、32、37、42、47、52 ℃进行RPA扩增