Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第2期
·146 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年2月

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Fura⁃2 AM was used to detect intracellular Ca flux. Results：The CCK⁃8 assay showed that PNU⁃282987 at a concentration of less
than 10 μmol/L had no inhibitory effect on cell proliferation，and this concentration significantly increased ALP activity in LPS ⁃
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stimulated DPSCs. Ca at a concentration of less than 2 mmol/L had no inhibitory effect on cell proliferation；Western blot and RT⁃
qPCR experiments showed that the expression of osteogenic/osteogenic related proteins（COL⁃I，DSPP，OPN，ALP，RUNX2，OSX），
genes（COL ⁃ I，DSPP，OPN，ALP，RUNX2，OSX），and mineralized matrix formation in LPS ⁃ stimulated DPSCs were significantly
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upregulated after treated with PNU⁃282987 and Ca ，with the most significant upregulation observed when the two were combined（P <
0.001）. Fura⁃2 AM Ca 2 + probe results revealed an increase in intracellular Ca 2 + in DPSCs. Conclusion：10 μmol/L PNU⁃282987
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combined with 2 mmol/L Ca can promote the odontogenic/osteogenic differentiation of LPS⁃stimulated DPSCs.
［Key words］ alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor；odontogenic/osteogenic differentiation；human dental pulp stem cell；calcium
ion；lipopolysaccharide
［J Nanjing Med Univ，2024，44（02）：145⁃153］

牙髓炎是口腔常见疾病之一，目前治疗牙髓炎 髓骨化骨基质中表达强烈 ［9］ ，证明其与成骨之间
的主流方法是摘除病变牙髓组织，行根管治疗，但 的独特联系。研究表明，α7⁃nAChR 抑制剂 MLA
失去牙髓的患牙丧失滋养、感觉、防御、形成功能， 会抑制细胞内Ca 的瞬变，可以使激动剂引起的Ca 2+
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［1］
会出现牙冠变色、脆而易折、继发龋风险增加 。然 内流快速衰减，同时抑制细胞内Ca 震荡的频率 。
［10］
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而，临床上难以获得自体健康牙髓组织分离牙髓干 而 该 受 体 的 激 动 剂 PNU ⁃ 282987，通 过 增 加 α7 ⁃
细胞（dental pulp stem cell，DPSC），再通过组织工程 nAChR 通道的开启时间来加强Ca 内流作用 。因
［11］
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策略再生牙髓组织。因此，如何利用病变牙髓组织 此，本研究认为，活化α7⁃nAChR，诱导Ca 内流，能够
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中DPSC原位促进牙髓组织再生成为研究热点。由 促进再生功能受损的DPSC成牙本质细胞向分化。
于牙髓组织具有较强抗感染及抵抗外界刺激等多 目前已有许多关于α7⁃nAChR在炎症治疗中的研
种作用 ，DPSC在病变牙髓组织中依然可以存活并 究，但是与牙髓炎状态下DPSC成牙本质细胞向分化
［2］
保留一定的再生能力，如何通过干预手段有效诱导 的研究未有报道。本研究拟通过分离培养DPSC，大肠
这类再生功能受损的DPSC成牙本质细胞向分化成 杆菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激DPSC模拟
为该热点的具体研究方向。 牙髓炎中再生功能受损的DPSC。通过α7⁃nAChR激
钙离子（calcium ion，Ca ）与DPSC成牙本质细胞 动剂PNU⁃282987，活化该受体，验证活化α7⁃nAChR
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向分化、促进牙体硬组织的再生有密切联系。据报 是否可以促进胞外 Ca 内流增加，诱导炎症刺激下
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道，促进细胞Ca 内流，可激活一系列牙/骨向分化相 DPSC 牙/骨向分化发挥的作用，为研制新型盖髓剂
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［3］
关信号转导通路，诱导 DPSC 的成牙本质向分化 。 用于临床活髓保存治疗提供助益。
改变牙髓炎组织中DPSC的再生潜能，使之通过向成
1 材料和方法
［4］
牙本质细胞分化，参与牙髓⁃牙本质复合体再生 。α7
乙酰胆碱受体（alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor， 1.1 材料
α7⁃nAChR）是一种烟碱乙酰胆碱受体，广泛存在于 PNU⁃282987（MCE 公司，美国），LPS（Sigma 公
神经元和非神经元细胞中，在牙髓细胞中表达。 司，美国），基础培养基α⁃MEM（Gibco 公司，美国），
它是由 5 个α7 单体组成的同型五聚体，在胆碱能 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco 公司，美
抗炎通路中发挥重要作用 。α7⁃nAChR 是胆碱能 国），磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，
［5］
抗炎通路的重要组成部分，α7⁃nAChR 激动剂 PNU⁃ Hyclone公司，美国），青霉素⁃链霉素（Gibco公司，美
282987 能够抑制肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis 国），胰蛋白酶（Gibco 公司，美国），Ⅰ型胶原酶（Sig⁃
factor alpha，TNF⁃α）和白介素⁃1β（interleukin⁃1 beta， ma 公司，美国），SDS⁃PAGE 凝胶试剂盒（上海碧云
IL⁃1β）等多种促炎因子的分泌 。同时，该受体表 天），蛋白 Marker（Fermentas 公司，美国），RUNX2 抗
［6］
现出对Ca 的高选择性渗透性，从而对细胞内Ca 水 体、DSPP 抗体、OSX 抗体、OPN 抗体、COL⁃I 抗体、
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平进行调控 。研究指出，α7⁃nAChR 参与牙体硬 ALP 抗体、抗甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃
［7］
组织形成的初始阶段，可能与该受体对钙的高渗透 3⁃phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Abcam 公
［8］
性相关 。此外，α7⁃nAChR在新形成的软骨内和骨 司，美国），CCK⁃8试剂盒（Dojindo公司，日本），碱性