Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第2期       李梦圆，王宇萌，徐青清，等. 活化α7乙酰胆碱受体促进LPS刺激的人牙髓干细胞牙/骨向分化［J］.
                  2024年2月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（2）：145-153                        ·147 ·


                磷酸酶染色试剂盒（上海碧云天），碱性磷酸酶（al⁃                         酶抑制剂 PMSF 的 RIPA 裂解液裂解 DPSC，提取细
                kaline phosphatase，ALP）检测试剂盒（南京建成公                胞内蛋白，配制检测液，520 nm波长处测定吸光度。
                司），RNA 提 取 试 剂 盒（无 锡 Bioteke），酶 标 仪               1.2.5 RT⁃qPCR
                ELx800（Bio⁃Tek instruments Inc公司，美国），微孔板              DPSC用LPS诱导后，分为对照组、PNU⁃282987、
                分光光度计（MD公司，美国），茜素红染液（Sigma公                       CaCl2、PNU⁃282987+CaCl2 4组。细胞培养7 d后，根
                司，美国），化学发光凝胶成像系统（GE公司，美国），                        据说明书用RNA提取试剂盒提取各组总RNA，然后
                流式细胞仪（BD公司，美国），ABI7500 real⁃time PCR              使用PCR 仪进行检测，引物序列见表1。以人GAP⁃
                系统（ABI公司，美国）等。                                    DH 为内参，采用2       -ΔΔct 方法进行数据分析，比较各组
                    本研究经南京医科大学附属江苏省口腔医院                           间基因表达情况。
                伦理委员会审核并批准（PJ2022⁃064⁃001）。

                1.2  方法                                                      表1   RT⁃qPCR使用引物序列
                                                                          Table 1  Primer sequences in RT⁃qPCR
                1.2.1 DPSC原代培养
                    选取本院口腔颌面外科根尖未发育完成的健康                            Gene     Prime       Prime Sequences（5′→3′）
                                                                   DSPP     Forward  TTAAATGCCAGTGGAACCAT
                的第三磨牙。用含有1%青霉素⁃链霉素的PBS冲洗，
                                                                            Reverse  ATTCCCTTCTCCCTTGTGAC
                无菌条件下取出牙髓，超净台内在200 μL α⁃MEM中
                                                                   COL⁃I    Forward  GCAAGGTGTTGTGCGATGA
                剪碎，加入 500 μL 3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和 200 μL
                                                                            Reverse  TGGTCGGTGGGTGACTCTG
                4 mg/mL 胰酶，在 37 ℃、5% CO2 条件下孵育消化                   ALP      Forward  CCTTGTAGCCAGGCCCATTG
                20 min。加入完全培养基，即含有10% FBS的α⁃MEM                             Reverse  GGACCATTCCCACGTCTTCAC
                终止消化。牙髓组织块悬液在 1 000 r/min 离心                       RUNX2    Forward  ACCTTGACCATAACCGTCTTCAC
                5 min后，接种于培养瓶中，于37 ℃、5% CO2孵箱中培                             Reverse  TCCCGAGGTCCATCTACTGTAAC
                养，每3 d换液。当细胞达到80%融合时，胰蛋白酶消                         OSX      Forward  TCCCAACTTCTTACACCATTGCTT
                化传代。本实验采用生长状态良好的第3代DPSC。                                    Reverse  GCCAGGTCACTAACCCCAATAC
                                                                   OPN      Forward  GCTCAGCACCTGAATGTACC
                1.2.2 DPSC的表面标志物鉴定
                                                                            Reverse  CCTCGGETCGATGGCTAGC
                    将DPSC用胰蛋白酶消化，经过离心重悬后，稀释
                细胞，置于EP管内。各管中分别加入荧光标记抗体                           1.2.6 免疫印迹分析
                CD90、CD73、CD105、CD34、CD146，空白对照组仅余                    DPSC用LPS诱导后，分为对照组、PNU⁃282987、
                细胞悬液。4 ℃条件下避光孵育1 h，1 000 r/min离心                  CaCl2、PNU⁃282987+CaCl2 4 组，用含有相应药物的
                5 min，弃上清，PBS漂洗，重悬，使用流式细胞仪检测。                     成骨诱导液培养 7 d 后，用 1%PMSF 的 RIPA 裂解细
                1.2.3 CCK⁃8实验                                     胞，超声振荡后，10 000 r/min 4 ℃ 下离心15 min，提
                    以 2 000 个/孔的密度在 96 孔板中铺 DPSC。用                取细胞总蛋白。制备 10%分离胶、4%浓缩胶、电泳
                CCK⁃8试剂检测PNU⁃282987和Ca 对DPSC增殖的                   缓冲液和转膜液。每个泳道加入等量蛋白，60 V恒
                                               2+
                影响。PNU⁃282987 的浓度梯度为 0、0.1、1.0、10.0、              压电泳用于浓缩胶，90 V恒压电泳用于分离胶。转
                25.0、50.0、100.0 μmol/L，CaCl2的浓度梯度为 0、0.5、         膜前用甲醇浸泡PVDF膜30 s，使其活化，将膜对准盖
                1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L，每个浓度梯度设置 3 个复              上胶，放入电转仪，300 mA恒流电转。含5%脱脂奶
                                                                  粉的TBST缓冲液在摇床上缓振摇2 h封闭，再将膜封
                孔。用CCK⁃8试剂于第0、1、3、5、7天，37 ℃ 5% CO2
                条件下孵育2 h，450 nm波长下测定吸光度。                          入1∶1 000稀释好的一抗，4 ℃冰箱过夜。次日，洗膜
                1.2.4 ALP染色及ALP活性测定                               后将膜放入配制好的二抗（1∶2 500），室温下慢摇
                    将 DPSC 置于含 10 mmol/L β⁃甘油酸磷酸钠、                1 h。最后，对膜进行曝光成像，Image J软件定量分析。
                50 μmol/L磷酸抗坏血酸和10 nmol/L地塞米松的完                   1.2.7  茜素红染色和氯代十六烷基吡啶（cetylpyri⁃
                全培养基即成骨诱导培养基中培养，加入所需浓度                            dinium chloride，CPC）定量
                的药物后，每2~3 d换液，直至第7天。4%的多聚甲                            DPSC用LPS诱导后，分为对照组、PNU⁃282987、

                醛固定30 min，ALP染色试剂盒配制染色液，在37 ℃                     CaCl2、PNU⁃282987+CaCl2组，加入含相应浓度药物
                下染色 5~30 min，ddH2O 终止，扫描仪及显微镜观                    的矿化诱导液，2~3 d 进行 1 次换液，培养 2 周后，
                察。与此类似，成骨诱导培养 7 d 后，用含 1%蛋白                       PBS 洗3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入茜素红染
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