Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第2期
·148 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年2月

色液，室温孵育10~30 min，ddH2O 洗，在扫描仪及显 99.9%、57.2%、99.9%），而造血干细胞标志物 CD34
微镜下采集图片。在茜素红染色的孔板内，将配制 表达阴性（0.13%，图2），证明成功提取DPSC。
的 10%CPC 加入孔板中溶解钙结节，置于摇床上孵
育 1 h，酶标仪测定595 nm各孔的吸光度。
1.2.8 Fura⁃2 AM测定DPSC内Ca 浓度
2+
用 PBS 将 Fura⁃2 AM 稀释成 5 μmol/L 的工作
液，去培养基，使用缓冲液洗涤细胞 3 次；将 Fura⁃2
AM工作液加入细胞；在37 ℃培养箱孵育30~60 min，
A B
用PBS洗3次除去Fura⁃2 AM工作液，分别加入PNU⁃ A：Adherant cells crawling out of the tissue mas. B：The first gener⁃
282987、CaCl2、PNU⁃282987+CaCl2，激光共聚焦显微 ation of DPSC after passaging is arranged in a long shuttle shape.
镜下观察。 图1 DPSC的细胞形态（×100）

1.3 统计学方法 Figure 1 Morphology of DPSC（×100）
实验均重复 3 次。运用 GraphPad Prism8 统计 2.3 CCK⁃8检测DPSC增殖
软件对数据进行统计分析，不同组间的差异使用 t CCK⁃8 结 果 显 示 ，当 PNU⁃282987 浓 度 低 于
检验或单因素方差分析。对于两组以上的比较， 10 μmol/L（图3A），CaCl2浓度低于2 mmol/L对DPSC
使用 Tukey’s 或 Dunnett’s 事后检验的单因素方差 细胞增殖无影响（图3B）。
分析（ANOVA）。P<0.05 为差异有统计学意义。 2.4 筛选PNU⁃282987的最佳矿化诱导浓度
调整浓度梯度后，在DPSC中分别加入10 μg/mL
2 结 果
LPS，ALP 染色（图 4A）和 ALP 活性（图 4B）实验证
2.1 DPSC的分离与培养 明，筛选出在此条件下 PNU⁃282987 促进 DPSC ALP
取年轻恒牙的牙髓，酶消化法提取原代细胞， 表达的最佳浓度为10 μmol/L。
在 3 d 后观察到贴壁细胞从组织块中爬出（图 1A）， 2.5 活化α7⁃nAChR 联合 Ca 对炎症环境下 DPSC
2+
传代后的第1代细胞呈长梭形排列（图1B）。 牙/骨向分化相关蛋白表达的影响
2.2 DPSC的鉴定 Western blot检测成骨诱导后炎症的DPSC各组
流式细胞术结果显示，DPSC 表达间充质干细 细胞中与成牙本质分化和成骨分化相关的蛋白
胞 标 志 物 CD73、CD90、CD146、CD105（99.9% 、 （COL⁃I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX）的表达。结果

CD34（-） CD73（+） CD90（+）
2.0k
CD34- CD34+ 300 CD73- CD73+ 2.0k CD90- CD90+
2.0k 4.0k
99.9 0.10 0.011 99.989 0.093 99.907
1.5k 1.5k 200
3.0k
200
Count 1.0k Count 1.0k Count 2.0K
150
500
100
100
0 500 1.0K
50
0 0
-10 3 0 10 3 10 4 10 5 -10 3 0 10 3 10 4 10 5 -10 3 0 10 3 10 4 10 5
FITC⁃A∶∶FITC⁃A PE⁃Cy7⁃A∶∶PE⁃Cy7⁃A APC⁃A∶∶APC⁃A
CD146（+） CD105（+）
250 CD146- CD146+ CD105+
1.5k 250 CD105-
42.8 57.2 0.099 99.901
200
250
Count 1.0k Count
100
500
50 250
0 0
-10 3 0 10 3 10 4 10 5 -10 3 0 10 3 10 4 10 5
PE⁃A∶∶PE⁃A PE⁃A∶∶PE⁃A
图2 DPSC表面抗原鉴定结果
Figure 2 Surface antigen identification results of DPSC