Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第3期
               ·306 ·                          南   京 医 科       大 学      学 报                        2024年3月


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              CCR8 Treg cells may provide new insights for improving the immunosuppressive state of tumor microenvironment in ovarian cancer.
             ［Key words］ ovarian cancer；C⁃C motif chemokine receptor 8；regulatory T cell；chemokine
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2024，44（03）：305⁃312］





                  卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，由于其发病                          ence 公司，美国）；重组鼠 IL⁃2（Peprotech 公司，美
              隐匿，进展迅速，且缺乏有效的早期筛查手段，多数                           国）；TGF⁃β（R&D 公司，美国）；PE/Cyanine7 标记的
              患者确诊时已为晚期。虽然免疫治疗是卵巢癌治                             抗 小 鼠 CD45、Brilliant Violet 510 标 记 的 抗 小 鼠
              疗的一个有前途的新领域，多种有希望的免疫治疗                            CD3、FITC 标记的抗小鼠 CD4、PE 标记的抗小鼠
              手段已被研发，但仍然需要克服免疫抑制性肿瘤微                            Foxp3、Brilliant Violet 421 标记的抗小鼠 CCR8、APC
              环境（tumor microenvironment，TME）以提高免疫治              标记的抗小鼠细胞毒性 T 淋巴细胞抗原 4（cytotoxic
              疗的疗效    ［1-3］ 。TME 中的免疫抑制是促进肿瘤生长                  T⁃lymphocyte antigen 4，CTLA⁃4）、APC 标记的抗小
              与转移最为重要的前提条件之一，是肿瘤免疫治疗                            鼠程序性细胞死亡蛋白 1（programmed cell death
                             ［4］
              的主要障碍之一 。免疫抑制性细胞及抑制因子是                            protein 1，PD1）、APC标记的抗小鼠淋巴细胞激活基
              肿瘤免疫抑制微环境的重要组成部分，调节性 T 细                          因3（lymphocyte⁃activation gene 3，LAG⁃3）、APC标记
              胞（regulatory T cell，Treg）是其中的重要一员，通过              的抗小鼠可诱导的 T 细胞共刺激分子（inducible T
              不依赖于细胞接触（分泌抑制性细胞因子）或依赖                            cell costimulator，ICOS）等流式抗体（Biolegend 公司，
              于细胞接触（调节抗原呈递细胞功能和介导靶细胞                            美国）；Ⅳ型胶原酶（Gibco 公司，美国）；Percoll 细胞
              的溶解或凋亡）的机制发挥免疫抑制功能，阻碍肿                            分离液、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ、谷氨酰胺（Sigma公
              瘤特异性免疫反应         ［5-7］ 。趋化因子⁃趋化因子受体               司，美国）。
             （C⁃C motif chemokine receptor，CCR）信号介导的募           1.2  方法
              集作用是肿瘤内 Treg浸润的主要机制。研究显示有                         1.2.1 TCGA数据库、GTEx数据库分析
              多个 CCR 通过与趋化因子配体（chemokine ligand，                     下载 426 例 TCGA 数据库中上皮性卵巢癌组织
              CCL）的 结 合 ，如 CCR4 ⁃ CCL17/22、CCR5 ⁃ CCL5、         （https：//portal.gdc.cancer.gov）与 88 例 GTEx 数据库
              CCR8⁃CCL1/18 和 CCR10⁃CCL28 等，参与招募 Treg            中 卵 巢 正 常 组 织（http：//gepia.cancer ⁃ pku.cn/）的
                    ［8-11］
              到 TME     。与正常组织驻留及外周 Treg 相比，人                   RNA⁃seq 数据，以|Log2TPM|>1 和 P＜0.05 为显著差
              肺癌、乳腺癌及大肠癌等肿瘤浸润性Treg上选择性                          异标准对趋化因子 CCL1、CCL18 作差异分析，并基
                          ［12］
              高表达 CCR8       。而 CCR8 在卵巢癌肿瘤浸润性                  于 R 包⁃GSVA［1.46.0］中提供的 ssGSEA 算法，计算
              Treg 上是否高表达，CCR8 Treg 是否是卵巢癌肿瘤                    各类免疫细胞：Treg、中性粒细胞、B 细胞、肥大细
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              浸润 Treg 的主要类型，相关问题尚未明确。因此，                        胞、Th17 细胞、Tgd细胞的浸润比例，使用Spearman
              本研究以小鼠卵巢上皮癌细胞ID8构建的卵巢癌荷                           统计方法分析基因 CCR8［ENSG00000179934.7］与
              瘤C57BL/6小鼠模型为对象，分析CCR8在卵巢癌肿                       各免疫细胞的相关性，使用R包⁃ggplot2［3.3.6］对分
              瘤浸润性Treg中的表达，及其对Treg分化的作用。                        析结果进行可视化。
                                                                1.2.2 小鼠皮下成瘤实验
              1  对象和方法
                                                                     本动物实验获得南京医科大学实验动物福利
              1.1  材料                                           伦理委员会批准（IACUC⁃2303001）。20 只 C57BL/6
                  C57BL/6小鼠卵巢上皮癌细胞ID8（深圳豪泰生                     小鼠购自南京集萃药康生物科技公司。5×10 个ID8
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              物公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素⁃链霉                         细胞在复苏后经过3次传代培养，制备成100 μL细胞
              素溶液、红细胞裂解液和DMSO溶液（上海碧云天生                          悬液，同时添加100 μL 20 mg/mL胶原蛋白的高浓度
              物公司）；高浓度基质胶（南京优宁维生物公司）；                           基质胶悬液，混匀后接种在小鼠腋下至侧腹的皮下部

              RPMI 1640 培养基（Hyclone 公司，美国），X⁃Vivo 15            位，接种之后，小鼠仍置于SPF环境继续生长21 d后
              培养基（Lonza 公司，瑞士）；小鼠初始 CD4 T Cell 提                CO2窒息处死，取脾脏、肿瘤组织、外周血样本。
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              取磁珠（Miltenyi 公司，德国）；AZ084（Med Chem Ex⁃            1.2.3 小鼠样本处理
              press 公司，美国）；CD3e 单抗、CD28 单抗（eBiosci⁃                  将脾脏组织碾磨后制备成单细胞悬液，使用红
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