Page 17 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第3期 陶子琦，茅晔鹏，刘书娜，等. CCR8在卵巢癌浸润性Treg上的表达与意义［J］.
2024年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（3）：305-312 ·307 ·

细胞裂解液分别分离出脾脏和外周血样本中的单 计学意义。
个核细胞。将新鲜的小鼠皮下卵巢肿瘤组织剪成
2 结 果
3
1 mm 的小块，在配制的原代组织消化液［RPMI⁃
1640 培 养 基 + 胶 原 酶 Ⅳ（1 μg/mL）+透明质酸酶 2.1 趋化因子 CCL18 在卵巢癌与癌旁组织中的表
（100 ng/mL）+DNA 酶 Ⅰ（50 U/mL）+ 谷 氨 酰 胺 达存在显著差异
（1 mmol/L）+1%青霉素⁃链霉素溶液］中 37 ℃消化 利用 TCGA 与 GTEx 公共数据库获取上皮性卵
1 h 后 40 μm 滤器过滤，将过滤后细胞悬液使用 巢癌组织以及卵巢正常组织的 RNA⁃seq 数据，分析
70% Percoll、30% Percoll梯度离心，得到单个核细胞 CCL1 mRNA 与 CCL18 mRNA 在卵巢癌中的表达情
悬液。 况，发现CCL1基因在人类卵巢癌组织（n=426）与卵

1.2.4 流式检测小鼠样本中Treg细胞上CCR8以及 巢正常组织（n=88）中无明显差异（图1A），CCL18基
免疫检查点相关蛋白的比例 因在人类卵巢癌组织中显著上调（非配对样本，P <
将小鼠脾脏、外周血、肿瘤组织的单个核细胞 0.05，图 1B）。同时对 CCL1、CCL18 的受体 CCR8 作
悬液铺在流式管底，加入PE/Cyanine7标记的抗小鼠 免疫浸润分析与Spearman相关性分析，绘制棒棒糖

CD45、Brilliant Violet 510 标记的抗小鼠 CD3、FITC 图（图2），结果显示CCR8基因与卵巢癌浸润的Treg
标记的抗小鼠 CD4、PE 标记的抗小鼠 Foxp3、Bril⁃ 细胞具有高相关性（R=0.592，P＜0.05）。
liant Violet 421 标记的抗小鼠 CCR8、APC 标记的抗
小鼠CTLA⁃4、APC标记的抗小鼠PDI、APC标记的抗 A 2.0 B *
小鼠 LAG⁃3、APC 标记的抗小鼠 ICOS 等流式抗体， （ TPM+1 ） 8 ）
经孵育、破核、洗涤、固定后使用Beckman Cytoflex流 1.5 6 （ TPM+1
式仪进行检测。
1.2.5 体外诱导小鼠Treg细胞实验 1.0
雌性 C57BL/6 小鼠，6~8 周龄，体重 18~20 g。 CCL1 mRNA expression⁃log 2 4
2%戊巴比妥麻醉小鼠，无菌操作下取脾脏，碾磨匀浆 0.5 0 CCL18 mRNA expression⁃log 2
分离脾脏细胞，裂解红细胞后得到单个核细胞，以磁 2
+
珠提取初始 CD4 T 细胞。圆底 96 孔板以 4 μg/mL
0
CD3 单抗 4 ℃包被过夜后，加入 15 ng/mL hTGF⁃β、 T N T N
30 U/mL鼠IL⁃2、2 μg/mL CD28单抗，将初始CD4 T细 （n=426）（n=88） （n=426）（n=88）
+
A：Chemokine CCL1 mRNA expression in epithelial ovarian cancer
6
胞以X⁃Vivo 15培养基调至1×10 个/mL铺在圆底96
tissues of TCGA（T group，n=426）and normal ovarian tissues of GTEx
孔板中，隔天半定量换液并传代。AZ084是 一 种 强
（N group，n=88）. B：Chemokine CCL18 mRNA expression in epithelial
效 的 CCR8 变 构 拮 抗 剂 ，其 Ki 值 为 0.9 nmol/L， ovarian cance tissues of TCGA（T group，n=426）and normal ovarian tis⁃
以DMSO作为溶剂溶解10 mg AZ084粉末，将其制备 sues of GTEx（N group，n=88），P < 0.05.
*
为AZ084储存液（5 mmol/L）。依据不同处理方式分 图 1 趋化因子 CCL1 和 CCL18 mRNA 在 TCGA 上皮性卵
为AZ084组、DMSO组与MOCK组。AZ084组在诱导 巢癌组织数据集和GTEx卵巢正常组织数据集中的表
达水平
过程中每日加入 5 μmol/L 的 CCR8 变 构 拮 抗 剂
Figure 1 Chemokine mRNA expressions of CCL1 and
AZ084，DMSO组在诱导过程中每日加入与AZ084组
CCL18 in epithelial ovarian cancer tissues of
同体积的DMSO溶液，MOCK组为空白对照，只诱导 TCGA and normal ovarian tissues of GTEx
分化不做其他任何处理。诱导培养3~5 d，流式检测
CD4 Foxp3 Treg细胞的比例。 2.2 CCR8 及免疫检查点相关蛋白 PD⁃1、CTLA⁃4、
+
+
1.3 统计学方法 LAG⁃3、ICOS在卵巢癌小鼠模型的肿瘤组织、外周血
所有数据使用 SPSS 25.0 统计软件进行数据分 及脾脏中Treg上的表达情况
析，各组数据均以均值±标准差（x ± s）表示，两组间 采用 CO2窒息法处死 8 例 C57BL/6 卵巢癌荷瘤
的比较，符合正态分布的数据用独立样本 t 检验， 小鼠，对其皮下瘤模型进行瘤体大小测量，根据公
多组间比较用单因素方差分析，非正态性分布数 式V=1/2× a×b（a为长轴，b为短轴）计算得出肿瘤体
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据采用 Mann⁃Whitney 检验。P＜0.05 为差异有统 积为800~1 200 mm（图3）。采用流式细胞术（图4）
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