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第44卷第4期          罗瑞熙，王文佳，王 平，等. 槲皮素通过调控内质网应激信号通路改善非酒精性脂肪肝大
                  2024年4月               鼠肝脏损伤［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（04）：445-454                   ·447 ·


                1.1.2  细胞及试剂                                      Que 每天灌胃 1 次，共灌胃 8 周，其余组予以蒸馏水
                    人肝癌细胞系（HepG2，CL⁃0103，武汉普诺赛生                   灌胃作为对照处理。各组动物在高脂喂养前1 d、第
                命科技有限公司）；Que（abs47048075，上海爱必信公司）；                4、8、12、16周进行体重、进食量检测。
                甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒（A110⁃1⁃1）、             1.2.2  血清生化指标检测
                总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒（A111⁃1⁃1）             检测前 1 d 禁食 16 h，第 2 天通过鼠尾静脉
                和油红 O 染液（D027⁃1⁃1）（南京建成生物工程研究                     采血，检测空腹血糖；收集外周血清全自动生化仪
                所）；大鼠胰岛素酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked                    进 行 TG、TC、低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇（low⁃density
                immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒（ZC⁃37507，上         lipoprotein⁃cholesterol，LDL⁃C）、高密度脂蛋白胆固

                海 茁 彩 生 物 科 技 有 限 公 司 ）；TRIzol         TM  试 剂    醇（high⁃density lipoprotein⁃cholesterol，HDL⁃C）、天冬
               （15596026，Ambion 公司，美国）；5×qRT SuperMix 和           氨酸氨基转移酶（glutamic oxalacetic transaminase，
                2×SYBR Green qPCR Master Mix（Bimake 公司，美          AST）、丙氨酸氨基转移酶（glutamic⁃pyruvic transami⁃
                国）；β⁃actin商业化荧光定量引物（B661202，上海生                   nase，ALT）水平检测。通过大鼠胰岛素 ELISA 试剂
                工公司）；RIPA 裂解液（R0010，北京索莱宝公司）；                     盒检测各组大鼠血清空腹胰岛素水平。
                BCA 蛋白定量试剂盒、10% PAGE 凝胶快速制备试                      1.2.3  糖耐量试验
                剂盒、蛋白酶抑制剂混合液、蛋白上样缓冲液、三色                               检测前1 d禁食16 h，第2天腹腔注射50%高糖

                预染蛋白标记蛋白、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene                    溶液（2.0 g/kg），分别于注射后 0、10、30、60、120 min
                fluoride，PVDF）膜（0.22 μm）和 快 速 转 膜 缓 冲 液           通过尾静脉采血利用血糖测试仪检测血糖变化情况。
               （上 海雅酶生物公司）；C/EBP 同源蛋白（C/EBP                       1.2.4  苏木素⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色
                homologous protein，CHOP）、激活转录因子4（activating           动物饲养16周后，戊巴比妥钠进行麻醉取血处
                transcription factor 4，ATF4）抗体（Bimake公司，美国）；      死后开腹完整取出大鼠肝脏进行形态学观察并拍
                葡萄糖调节蛋白 78（glucose regulation protein 78，         照。之后对肝脏组织进行称重及体积测量（量筒
                BiP）、X⁃盒结合蛋白 1s（X box⁃binding protein⁃1s，         法）。肝脏组织经石蜡包埋成块后，在组织切片机
                XBP⁃1s）和X⁃盒结合蛋白1u（X box⁃binding protein⁃1u，       上切片留存以备下一步组织学染色。切片分别在
                XBP⁃1u）抗体（武汉 Proteintech 公司）；激活转录因                二甲苯Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中分别浸泡 5 min 进行脱
                子 6（activating transcription factor 6，ATF6）抗 体    蜡；而后依次在100%、95%、90%、80%和70%乙醇中
               （D262665，上海生工公司）；β⁃肌动蛋白（β⁃actin，                   各浸泡 5 min 进行脱水并用蒸馏水冲洗；加入苏木
                bsm⁃33036M，北京博奥森公司）；辣根过氧化物酶标                      素染液染 3~8 min，蒸馏水冲洗后 1%盐酸酒精分化
                记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，                   5~10 s，蒸馏水冲洗干净；加入伊红染液染 3 min 后
                IgG，AS014）和山羊抗小鼠IgG（AS003）（武汉ABclonal             冲洗干净；再依次加入70%、80%、90%、95%和100%
                公司）；棕榈酸（palmitic acid，PA，P432956，上海阿              乙醇浸泡5 min脱水；之后分别在二甲苯Ⅰ液、Ⅱ液
                拉丁公司）；衣霉素（tunicamycin，TM，T7765，Sigma              中浸泡 5 min 透明化；最后盖玻片封片后显微镜下
                公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒（abs50003，上海爱必                    观察染色结果。
                信公司）。                                             1.2.5 马松（Masson）染色
                1.2  方法                                               脱水步骤与 HE 染色相同，而后加入苏木素染
                1.2.1  动物分组及模型建立                                  色染核 1~2 min，蒸馏水冲洗后 1%盐酸酒精分化
                    大鼠适应性饲养 1 周后，遵循体重随机分配原                        3~5 min，蒸馏水冲洗；加入 Masson 丽春红染液染
                则按实验设计分为以下 4 组：正常对照组（Control，                     5~10 min，1% 磷钼酸溶液洗 2~3 min，1%苯胺蓝染
                8 只，普通饲料喂养）；模型组（HFD，8 只，高脂饲料                      液染 5 min；最后经 95%、100%乙醇脱水，二甲苯透
                喂养）；Que低剂量组［HFD+Que（L），5只，高脂饲料                    明，中性树胶封固后镜下观察并拍照。

                喂养，25 mg/kg Que 灌胃］；Que 高剂量组［HFD+Que              1.2.6  油红O染色
               （H），5 只，高脂饲料喂养，50 mg/kg Que 灌胃］。高                      组织冰冻切片后中性甲醛固定 5~10 min，清洗
                脂饲料喂养 8 周后，正常对照组和模型组各取 3 只                        后加入配制好的油红 O 工作液染色 10 min；清洗后
                大鼠麻醉处死检测模型建立情况，其余继续喂养。                            加入苏木素染液染核1 min；超纯水清洗后显微镜观
                各干预组于高脂饲养第 8 周建模成功后开始进行                           察染色结果。
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