Page 8 - 南京医科大学自然版
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第44卷第6期
               ·744 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年6月


                                                ［2］
              大别班达病毒（Dabie bandavirus，DBV） ，曾被称为                酸激酶（creatine kinase，CK）逐渐下降；⑤其他中毒
              发热伴血小板减少综合征病毒。其主要临床症状                             症状、体征逐渐改善或消失。
              为高热、血小板减少、白细胞减少、胃肠道不适等，                           1.2.3  患者血浆抗体效价检测
              严重时会造成多器官损伤、各种并发症如细菌或真                                 分别将 DBV⁃Gn 和 DBV⁃NP 作为 ELISA 包被抗
              菌感染、神经系统症状等          ［3-5］ ，病死率为12%~30%   ［6-8］ 。  原，封闭后加入起始稀释度为1∶50的恢复期患者血
              大部分患者预后良好，老年患者和有基础疾病的患                            浆，并依次进行梯度稀释，均设 3 个复孔，同时设空
              者临床预后较差        ［9-11］ 。目前，临床上尚无针对 SFTS            白对照孔与正常人血浆对照孔。二抗加入 1∶2 000
              的有效预防性疫苗和特异性抗病毒药物，治疗手段                            稀释的 Anti⁃Human IgG⁃Fc。酶标仪在波长 450 nm
                                             ［12］
              主要为对症治疗和对并发症的治疗 。                                 处测定吸光度值。
                  本研究以 SFTS 恢复期患者外周血单核细胞                        1.2.4  患者血样中PBMC的提取
             （peripheral blood mononuclear cell，PBMC）为样本，            全血离心后将血细胞与PBS按1∶1比例混合均

              通过磁珠富集与流式分选获得 DBV 糖蛋白（DBV                         匀，缓慢轻柔地加入1.5倍淋巴细胞分离液中，缓升
              glycoprotein，DBV⁃Gn）特异性单个 B 细胞，利用 B 细             缓降 2 000 r/min 离心 20 min，吸取上层和中层分界
              胞受体（B cell receptor，BCR）测序获得抗体可变区序                处液面的细胞层并加入适量PBS进行离心，加5 mL
              列，原核表达出6个与DBV具有中和活性的抗体，为                          红细胞裂解液重悬，孵育 5~10 min 后，用适量 PBS
              后续病原体诊断和抗病毒药物的研发奠定技术基础。                           将细胞洗涤2~3次获得PBMC。
                                                                1.2.5 B细胞磁珠富集
              1 材料和方法
                                                                     将 PBMC 重悬于浓度为 0.1 mg/mL 的 DNase 溶
              1.1  材料                                           液，室温孵育 15 min 裂解完成后用 37 μm 过滤器过
                  非洲绿猴肾细胞（Vero）、DBV⁃JS14 病毒株和                   滤细胞，重悬于 1 mL 缓冲液。在细胞中加入 50 μL
              DBV核衣壳蛋白（DBV nucleocapsid protein，DBV⁃NP）         Cocktail 工作液，轻柔混匀室温孵育 10 min，接着在
              质粒由本实验室保存；BL21感受态细胞（北京全式金                         细胞中加入预先 30 s 涡旋混匀的磁珠 75 μL，混匀
              生物有限公司）；DBV⁃Gn蛋白（南京金斯瑞生物科技                        后室温孵育5 min。加缓冲液将体积定容至2.5 mL，
              有限公司）；37 μm 过滤器（STEMCELL Technologies             去掉管盖放入磁力架中，室温孵育 5 min，连同磁力
              公司，加拿大）；候选抗体原核质粒（上海生工生物                           架自然倒置2~3 s，富集PBMC中的B细胞。
              工程股份有限公司）；恢复期患者血液样本收集自                            1.2.6  流式细胞仪分选Gn特异性单个B细胞
              南京医科大学第一附属医院。患者基本信息和临                                  将磁珠富集的 B 细胞重悬于 100 μL 流式缓冲
              床血液样本的获取获得了南京医科大学第一附属                             液，按 1∶100 的比例加入 CD19⁃APC 抗体、IgG⁃BV
              医院伦理委员会的许可（2022⁃SR⁃366）。                          421 抗体、IgM⁃BV 605 抗体、CD27⁃APC/Cyanine7
                                                                   TM
                                                                                     TM
              1.2  方法                                           抗体和 Gn⁃FITC 抗原，冰上避光孵育 30 min。孵育
              1.2.1  病毒抗原NP的表达                                  结束后用 200~300 μL PBS 重悬细胞，用于流式分
                  将NP⁃pET28a质粒转染至BL21感受态细胞中，                    选，将 DBV⁃Gn 特异性单个 B 细胞分选到含有裂解
              挑取单克隆菌落进行扩增培养与诱导，超声破碎后                            液的96孔板中，冰上放置待用。
              对上清中的蛋白通过Ni 亲和层析柱梯度纯化获得                           1.2.7  单个B细胞的BCR测序
                                    2+
              DBV⁃NP蛋白。                                              将分选到的单个 B 细胞经反转录和 PCR 扩增

              1.2.2  SFTS恢复期患者血液样本的收集                           后，对cDNA产物进行3轮BCR富集并用磁珠纯化，
                  SFTS 恢复期患者的诊断标准如下             ［12-14］ ：①血液    经过片段化、接头连接、扩增和片段分选后，获得可

                                  3
              中 DBV 载量<4.96×10 拷贝/mL，确定为 DBV⁃RNA                测序的文库进行测序，得到抗体序列。
              转阴性；②体温逐渐下降至恢复正常且稳定 3 d 以                         1.2.8 包涵体的复性与蛋白免疫印迹（Western blot）
              上；③血小板（platelet，PLT）和白细胞（white blood              鉴定
              cell，WBC）计数逐渐升高；④血生化酶学指标如丙                             将分析后的抗体序列委托上海生工生物工程
              氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天           有限公司进行基因合成并装载至载体 pET28a，转
              门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，             染至 BL21 感受态细胞中进行原核表达。超声破碎
              AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌           后对包涵体进行梯度透析复性，12% SDS⁃PAGE
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