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第44卷第6期             徐若薇,韩一芳,周婷婷,等. 全人源抗大别班达病毒抗体的制备及功能鉴定[J].
                  2024年6月                     南京医科大学学报(自然科学版),2024,44(6):743-752                        ·749 ·


                                                        表2 BCR测序统计
                                                  Table 2 BCR sequencing statistics

                                            Number of cells with  Reads mapped
                                Estimated                                  Reads mapped  Reads mapped  Reads mapped
                   Sample                     productive V⁃J  to any V(D)
                              number of cells                               to IGH(%)    to IGK(%)     to IGL(%)
                                               panning pair    J gene(%)
                Healthy control    8               4             95.10        39.88        32.14         29.30
                Sample group 1     6               4             00.14        00.05        00.06         00.04
                Sample group 2     8               4             94.21        38.85        26.30         34.77
                Sample group 3     7               2             04.30        01.88        02.38         00.10


                2.6  抗体表达与Western blot鉴定                          A                        B
                                                                    kDa M  1  2 3  4  5  6  kDa M 1 2 3 M 4 5 6
                    将序列分析重组后获得 6 个单链抗体,原核表
                                                                    170                     170
                达并用 Ni 亲和离子层析柱纯化出目的条带,均为                            130                     130
                         2+
                                                                    100
                                                                                            100
                包涵体蛋白,条带为 30 kDa 左右。通过脲素透析                           70                      70
                                                                     55                      55
                均复性成功。抗体 HL13 电泳结果显示在 40 kDa
                                                                     40                      40
                处仍有未除去的杂蛋白,纯化过程还需进一步优化                               35                      35
               (图5A)。                                                25
                                                                                             25
                    因抗体的原核载体上具有6×His序列,取500 ng
                                                                     15                      15
                蛋白经 12% SDS⁃PAGE 电泳之后用 6×His⁃Tag 抗体                  10                      10
                对目的蛋白进行Western blot 鉴定,发现6个抗体在                        A:Identification of antibodies by SDS⁃PAGE. B:Identification of
                30~35 kDa 处均有明显单一的条带(图 5B),证明抗                     antibodies by Western blot. M:Marker;1:HK11;2:HL13;3:HK14;4:
                                                                                 HL25;5:HK26;6:HK27.
                体均表达成功。
                                                                                图5 抗体表达与鉴定
                2.7  抗体与DBV结合活性分析                                    Figure 5 Expression and identification of antibodies
                    候选抗体为一抗,6×His⁃Tag⁃HRP 为二抗。与
                空白对照和pET28a空载阴性对照相比,发现6个候                         因此将所有抗体进行细胞水平的体外病毒中和
                选抗体对 DBV 均具有良好的结合活性(图 6),当抗                       实验。由荧光定量 PCR 扩增图谱可见,HK11 抗
                体浓度为50 μg/mL时,酶标仪450 nm处的吸光度值                     体组的循环数(cycle threshold,Ct)大于病毒对照组
                在1.5左右,根据吸光度值以及稀释倍数判断,抗体                         (图 7A),则说明HK11抗体组病毒滴度小于病毒对
                HK11与DBV的结合能力较强,抗体滴度也较高。                          照组。分析各抗体组Ct值和病毒数量发现,当初始
                                                                                  3
                2.8  抗体与DBV中和活性分析                                 病毒滴度为 1×10 TCID50/mL 时,6 个抗体对 DBV 均
                    6 个候选抗体均表现出与 DBV 的结合能力,                       具有中和作用,抗体浓度为 300 μg/mL 时,抗体

                      A                                       B
                         2.0                                      2.0                           HK11
                                    P < 0.01
                                                                                                HK13
                                                                                                HK14
                         1.5                                                                    HK25
                                                                                                HK26
                        nm)                                       1.5                           HK27
                                                                                                Negative control
                        (450  D  1.0                            nm)  1.0                        Blank control
                         0.5                                    (450  D
                                                                  0.5
                           0
                                         Negative control          0  1  2  4  8  16  32 64  128
                            HK11  HL13  HK14  HL25  HK26  HK27
                                             Blank control
                                                                            Antibody dilution
                   A:The binding ability between different antibodies(50 μg/mL)and DBV. B:The binding ability between gradient diluted antibodies and DBV.
                                                  图6 候选抗体的DBV结合能力分析
                                 Figure 6  Analysis of the binding ability between candidate antibodies and DBV
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