Page 18 - 南京医科大学自然版
P. 18

第44卷第6期
               ·754 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年6月


              SUMO 化修饰是一个动态可逆的过程，SUMO 前体
                                                                1 材料和方法
              在泛素样蛋白加工酶（ubiquitin⁃like protein⁃specific
              protease，ULP）或SUMO特异性蛋白酶（sentrin⁃specific         1.1  材料
              protease，SENP）的加工下产生 SUMO⁃GG，由 SUMO                    WT 和 Senp1 -/-  MEFs 由上海交通大学医学院
              E1 酶（Aos1 ⁃ Uba2）激 活 ，转 移 到 SUMO E2 酶             程金科教授馈赠；肾上皮细胞 HK⁃2 和 ccRCC 细胞
             （Ubc9），并通过 SUMO E3 连接酶（PIAS）与底物结                   Caki⁃1、Caki⁃2、A498、786⁃O 均购于武汉普诺赛公
              合，最后，修饰底物可通过 ULP/SENP 发生去 SUMO                    司；DMEM 培养基、MEM 培养基、RPMI⁃1640 培养
              化，使蛋白质的 SUMO 化和去 SUMO 化处于动态平                      基、McCoy’s 5A 培养基、胎牛血清、0.25%EDTA⁃胰
              衡状态   ［2-3］ 。                                     蛋白酶（Gibco 公司，美国）；青霉素/链霉素（苏州
                  在哺乳动物中，去 SUMO 化酶 SENP 共有 6 种，                 新赛美公司）；RNAiso Plus 细胞总 RNA 提取试剂
              SENP1 作为去 SUMO 化酶之一，拥有广泛的特异                      （TaKaRa 公司，日本）；HiScriptⅡ Q⁃RT SuperMix for
              性底物，这些底物参与多种细胞生物学过程，如                             qPCR（gDNA wiper）逆 转 录 试 剂 盒 及 AceQ qPCR
              信号转导、细胞增殖、凋亡等             ［4-6］ 。近年来，越来越          SYBR Green Master Mix 荧光定量 PCR 试剂盒（南
              多的研究发现 SENP1 在多种肿瘤中呈现出异常                          京诺唯赞公司）；Duolink PLA 试剂盒（Sigma 公司，
                                                                                      ®
              的高表达     ［7-10］ ，促进肿瘤的发生发展，如在乳腺癌                  美国）；转 染 质 粒 试 剂 Plus Reagent（Thermo 公
                                                                                           TM
              中，高表达的 SENP1 通过调控细胞周期素依赖性                         司，美国）；Lamin B1、α⁃Tubulin、Spop、HA 抗体（武
              激酶 p21、p27 以及基质金属蛋白酶 9 的表达促进                      汉三鹰）；Sumo1 抗体（CST 公司，美国）；c⁃Myc 抗体
              肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。由于 SENP 在肿                         （Sigma公司，美国）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗
              瘤中的重要作用，其已被确定为肿瘤治疗的分子                             小鼠或抗兔 IgG（Jackson ImmunoResearch 公司，美
              靶标  ［11］ 。                                        国）；MG132、放线菌酮（cycloheximide，CHX）（Sgima
                  SPOP（speckle type BTB/POZ protein）是泛素连        公司，美国）；Myc⁃Senp1、Flag⁃Spop、Flag⁃Spop⁃K95R、
              接酶 E3 家族成员 Cul3 结合底物的接头蛋白，介导                      Flag⁃Spop⁃K110R、Flag⁃Spop⁃K95/110R 质粒均为本
              许多核蛋白的泛素化修饰，导致蛋白降解，从而调                            实验室自行构建。
              控细胞的多种生理过程           ［12］ 。已有研究证实，SPOP的           1.2  方法
              缺失或突变与多种肿瘤密切相关，包括前列腺癌、                            1.2.1  细胞培养
              乳腺癌、结直肠癌等         ［13-14］ 。其中受SPOP影响最为显                WT 和 Senp1 -/-  MEFs 使用含 10%胎牛血清的
              著的是肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，        DMEM 高糖培养基，肾上皮细胞 HK⁃2 和 ccRCC 细
              ccRCC）。SPOP蛋白在正常肾脏组织中表达量非常                        胞 A498 使 用 含 10% 胎 牛 血 清 的 MEM 培 养 基 ，
              低，但在 99%的 ccRCC 组织中却大量表达，表明                       ccRCC细胞Caki⁃1和Caki⁃2使用含10%胎牛血清的
              SPOP 蛋白是一个潜在的 ccRCC 分子标志物。由于                      McCoy’s 5A 培养基，ccRCC 细胞 786⁃O 使用含 10%
              SPOP在ccRCC中的重要作用，其已被确定为ccRCC                      胎牛血清的 RPMI⁃1640 培养基，置于 37 ℃、5% CO2
              治疗的新靶点。前人根据SPOP所识别底物蛋白的                           培养箱中进行培养。取处于对数生长期的细胞进
              晶体结构特点，获得了能够与 SPOP 蛋白结合的小                         行后续实验。
              分子化合物，并在体内和体外验证了其作用                      ［15-16］ 。  1.2.2  细胞转染

              ccRCC中SPOP的相关研究虽然很多，但其在ccRCC                           细胞汇合度达 70%~80%时，加入质粒转染液，
              中特异性高表达的机制还未见报道。                                  转染 6~8 h 后，换成正常的细胞培养液继续培养至
                  2022 年 Lee 等 ［17］ 发现，去 SUMO 化酶 SENP1 在        36~48 h，提取细胞总RNA和总蛋白进行后续实验，
              ccRCC中存在异常的高表达。本课题组通过实验发                          或者是培养至一定时间，收集瞬时转染的细胞，进

              现，在 Senp1 敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（murine                     行后续的实验。
              embryonic fibroblasts，MEFs）中，Spop 的蛋白水平有          1.2.3  细胞总RNA和总蛋白的提取

              所下降。因此，本研究拟探讨去 SUMO 化酶 Senp1                           细胞总 RNA 的提取：收集细胞，先将细胞用
              是否参与Spop的蛋白水平调控，并在ccRCC中初步                        PBS清洗1遍，加入RNAiso Plus，冰上静置 5 min，加

              探索 SENP1 与 SPOP 之间的相关性，以期为 ccRCC                  入1/5体积的氯仿，4 ℃冰箱静置10 min，4 ℃ 12 000 g
              的治疗提供新的思路。                                        离心 10 min。离心后，上清移至干净的 RNase⁃Free
   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23