Page 19 - 南京医科大学自然版

第44卷第6期 张赟豪，韩博昂，王 瑜，等. SENP1在SPOP去SUMO化修饰中的作用研究［J］.
2024年6月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（6）：753-761 ·755 ·

离心管中，加入等体积异丙醇，混匀-20 ℃冰箱冷冻 ZEN 3.0（blue edition）软件。
1 h，4 ℃ 12 000 g 离心 10 min，弃上清，加入 75%乙 1.2.8 蛋白周转速率检测
醇（DEPC 水配制），4 ℃ 12 000 g 离心 5 min，弃上 细胞接种于6孔板，待细胞长满后，用终浓度为
清，4 ℃晾干10 min，加入10 μL DEPC水，冰上溶解 20 μmol/L 的蛋白合成抑制剂CHX分别处理细胞各
30 min，测定RNA浓度。 种不同时间，在相应时间点，收取蛋白样品进行
细胞总蛋白的提取：收集细胞，先将细胞用 Western blot分析。
TBS 清洗 1~2 遍，加入适量的 RIPA 裂解液，刮板快 1.2.9 相关性分析
速刮下细胞，将裂解液收集于干净的1.5 mL离心管中， 从GEO数据库中下载ccRCC患者的基因表达数
冰上裂解 15~30 min，4 ℃ 14 000 r/min 离心 20 min， 据（GSE73731），利用 GraphPad Prism 7.0 对 SENP1
离心后，将上清移至新的 1.5 mL 离心管中，吸取适 与 SPOP 的基因表达进行皮尔逊相关系数分析并
量蛋白液进行 BCA 蛋白浓度的检测。加入相应 作图。
体积的 5×上样缓冲液，95 ℃煮 5 min，使蛋白完全 1.3 统计学方法
变性。 采用 GraphPad Prism 7.0 进行统计分析并作

1.2.4 免疫印迹实验（Western blot） 图。计量资料采用均数±标准差（x ± s）表示，组内
制备好的蛋白样品常温14 000 r/min离心1 min， 比较采用重复测量数据的方差分析，两组间比较采
在 SDS⁃PAGE 胶上进行电泳。经湿转法恒压 80 V， 用 t 检验分析，多组间比较采用单因素方差分析。
转膜 2 h，脱脂牛奶室温封闭 1 h，加一抗 4 ℃过夜。 P < 0.05为差异有统计学意义。
次日，TBST 洗膜 3 次，每次 15~20 min。室温孵育二
抗2 h，洗膜后化学发光显影。 2 结 果
1.2.5 实时荧光定量PCR 2.1 Senp1 敲除下调 Spop 蛋白水平但不影响其
使用 RNAiso 提取细胞总 RNA，逆转录试剂盒 mRNA水平
进行反转录，取10 μL反转录产物稀释至100 μL，取 为了研究 Senp1 是否参与调控 Spop，本研究提
-/-
1 μL做模板进行荧光定量PCR，软件Light Cycler 96 取了WT和Senp1 MEFs的RNA和蛋白，检测Senp1
分析数据。每个实验组有 3 个复孔，实验结果重复 敲除对于 Spop 表达的影响。结果显示，Senp1 敲除
3 次。引物序列：GAPDH 上游 5′⁃CGACCACTTTGT⁃ 后，Spop 的蛋白水平显著下降（图 1A、B），但其
CAAGCTCA ⁃ 3′ ，下 游 5′ ⁃ CCCTGTT GCTGTAGC⁃ mRNA水平没有明显变化（图1C）。由于Senp1是去
CAAAT⁃3′；Spop 上游 5′⁃CCACCTCCGGCAGAAAT⁃ SUMO 化酶，所以上述结果提示 Senp1 可能参与了
GTC⁃3′，下游5′⁃ CCTCCCGGCAAAAACTAAAGT⁃3′。 Spop的SUMO化修饰过程。
1.2.6 邻位连接技术（proximity ligation assay，PLA） 随后，为了进一步确认 Senp1 对 Spop 蛋白水平
细胞转染质粒 24 h 后，PBS 清洗 1 遍，4%甲醛 的调控作用，在 Senp1 -/- MEFs 中梯度回补了 Senp1
固定细胞，0.3% NP⁃40 透化细胞，根据 PLA 试剂盒 蛋白。Western blot 结果显示，随着 Senp1 蛋白水平
中的步骤进行封闭、一抗孵育、添加探针、连接、扩 的升高，Spop 的蛋白水平也随之梯度升高（图 1D），
增、封片，最后用激光共聚焦显微镜进行拍照分析。 进一步说明去SUMO化酶Senp1能够调节Spop的蛋
1.2.7 免疫荧光染色 白水平。
细胞转染后24 h，将细胞接种于用0.1%明胶包 2.2 Senp1敲除后Spop蛋白稳定性下降
被的细胞爬片上，继续培养 24 h 后，PBS 清洗 1 遍， 通常认为，影响底物蛋白的降解速率，即蛋白

4%甲醛固定细胞，使用抗体稀释液（3% BSA、0.3% 周转率，是 SUMO 化修饰对底物蛋白进行调控的重
Triton X⁃100，溶于 PBS）4 ℃下封闭并透化细胞 1 h， 要手段。为了检测Senp1是否影响Spop的蛋白周转
之后4 ℃孵育一抗过夜。使用TBST 清洗细胞2次， 率，利用 CHX（20 μmol/L）分别处理 WT 和 Senp1 -/-
每次3~5 min，之后室温条件下荧光二抗避光孵育1 h， MEFs不同时间后检测细胞中Spop的蛋白水平。结
-/-
不同荧光二抗使用的稀释比例均为 1∶200。TBST 果显示，Senp1 MEFs 中的 Spop 含量下降到 50%的
清洗细胞 3 次，每次 3~5 min。最后使用封固剂（含 时间要短于 WT MEFs（图 2A、B），表明 Senp1 敲除
DAPI）将细胞爬片固定在载玻片上。拍摄使用 后，Spop的蛋白周转率变快，蛋白稳定性下降。
LSM900 激光共聚焦显微镜图像，图像处理使用 后续，为了研究Spop蛋白是否通过蛋白酶体途