Page 20 - 南京医科大学自然版
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第44卷第7期
               ·904 ·                          南   京 医 科       大 学      学 报                        2024年7月


              1.2.5  免疫组织化学分析                                       100                                RA⁃Saline
                                                                                                       RA⁃AZM
                  将肺组织进行切片，用抗 vWF 抗体（标记肺                           （%）                ▲  ▲           ▲  O2⁃Saline
              血管，1∶5 000 稀释）、抗 CD 68 单克隆抗体（标记巨                                          ▲  ▲  ***     ▲  O2⁃AZM
              噬细胞，1∶500 稀释）、抗 MPO 抗体（标记中性粒细                        Probability of survival  50  ▲
              胞，1∶1 000稀释）、抗a⁃SMA抗体（标记次级肺泡隔，
              1∶10 000稀释）作为一抗孵育，1% BSA作为对照，二
              抗孵育用 HRP 偶联的抗小鼠/兔抗体（1∶1 000 稀                          0
                                                                       0        5        10        15
              释）。使用显色底物 NovaRed 显色。在 200 倍放大                                       Time（d）
              倍数下观察vWF染色阳性的切片，每个组织取非重                               The 10⁃day survival curve of neonatal rats in the RA⁃Saline group
              叠 10 个代表性视野，计数每个视野肺血管的个数，                         （n=22），RA⁃AZM group（n=22），O2⁃Saline group（n=23），and the O2⁃AZM
                                                                          ***
                                                                group（n=22）， P < 0.001 .
              取平均值代表每只动物的肺血管密度；在 400 倍放
                                                                     图2   AZM对高氧暴露新生大鼠生存率的影响
              大倍数下观察 CD68 及 MPO 染色阳性的切片，每个                      Figure 2  Effect of AZM on the survival rate of neonatal
              组织取10个代表性视野，计数每视野巨噬细胞及中                                    rats exposed to hyperoxia
              性粒细胞数量，最后求平均值；在400倍放大倍数下
              观察a⁃SMA染色阳性的切片，在10个非重叠视野中                         O2⁃Saline组比较，O2⁃AZM组MCP⁃1、PAI⁃1、IL⁃6表达
              对每个组织中的次级肺泡隔的数量进行计数，并校                            水平明显降低（P < 0.05），CINC⁃1 水平有下降趋
              正/标准化组织面积        ［15］ 。所有计数方式均为双人双                势，但差异无统计学意义（P=0.07）。肺组织匀浆的
              盲计数取平均值。                                          ELISA 定量结果显示，IL⁃6 及 MCP⁃1 在高氧暴露组
              1.2.6  ELISA检测细胞因子                                表达明显升高（P 均 < 0.05），O2⁃AZM 组较 O2⁃Saline
                  将肺组织进行匀浆，用蛋白裂解液提取蛋白，                          组IL⁃6表达明显降低（P < 0.05），而MCP⁃1的表达有
              待充分裂解后，台式离心机预冷至4 ℃，14 000 r/min                   下降趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05，图3）。
              离心 20 min，取上清液分装至 EP 管备用，用 BCA 法                  2.3 AZM对高氧暴露新生大鼠肺部炎症细胞的影响
              测定溶液总蛋白的浓度。将蛋白提取液稀释至合                                  分别用CD68和MPO标记巨噬细胞和中性粒细
              适的浓度进行 IL⁃6、MCP⁃1 细胞因子浓度检测，最                      胞，如图 4 所示，RA⁃Saline 及 RA⁃AZM 组肺组织无
              终根据总蛋白浓度算得 IL⁃6、MCP⁃1 的终浓度，以                      明显炎症细胞聚集，而 O2⁃Saline 组表现出明显炎症
              pg/mg表示。                                          细胞聚集现象，表现为 O2⁃Saline 组巨噬细胞计数明
              1.3  统计学方法                                        显增加（P < 0.001），中性粒细胞计数明显增加（P <
                  实验数据统计及分析用 GraphPad Prism 8 软                 0.001）；而AZM 干预后炎症细胞聚集现象明显受到
              件，实验数据结果以均数±标准误 （x ± sx） 表示，多组                    抑制，表现为 O2⁃AZM 组巨噬细胞数量明显减少
              间比较采用单因素方差分析，通过Sidak校正的t检                        （P < 0.01），中性粒细胞计数也显著减少（P < 0.001，
              验进行多重比较，用 Kaplan⁃Meier 分析方法绘制生                    图4）。
              存曲线，通过Log⁃rank检验进行统计分析，采用双侧                       2.4  AZM对高氧暴露新生大鼠肺发育的影响
              检验，P < 0.05为差异有统计学意义。                                  如图 5 所示，RA⁃Saline 组及 RA⁃AZM 组新生大
                                                                鼠肺组织肺泡大小均匀，形态规则，肺泡间隔无明
              2 结    果
                                                                显增厚，而 O2⁃Saline 组新生大鼠肺组织结构排列紊
              2.1  AZM对高氧暴露组新生大鼠生存率的影响                          乱，肺泡腔明显增大，肺泡间隔增厚，肺血管减少，
                  如图 2 所示，RA⁃Saline 组新生大鼠无死亡，                   O2⁃Saline对比RA⁃Saline组MLI明显增大（P < 0.001），

              O2⁃Saline 组对比 RA⁃Saline 组生存率明显下降（P <              次级肺泡隔（a⁃SMA染色）数量明显减少（P < 0.001），
              0.001），O2⁃AZM组对比O2⁃Saline组10 d存活率差异               提示 BPD 模型成功，而 O2⁃AZM 组对比 O2⁃Saline 组
              无统计学意义（P > 0.05）。                                 肺泡腔有所减小，MLI 明显减小（P < 0.05），次级肺

              2.2  AZM对高氧暴露肺损伤炎症因子/炎症趋化因                        泡隔数量明显增多（P < 0.05）。
              子的作用                                              2.5 AZM对高氧暴露新生大鼠肺血管发育的影响
                  与RA⁃Saline组比较，O2⁃Saline组MCP⁃1、CINC⁃1、              O2⁃Saline 组对比 RA⁃Saline 组肺血管密度明显
              IL⁃6、PAI⁃1 mRNA表达水平明显升高（P < 0.05），与               下降（P < 0.001），O2⁃AZM 组肺血管密度明显增加
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