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第44卷第7期 王燕琼，黄智峰，陈雪雨，等. 阿奇霉素对高氧暴露新生大鼠肺损伤保护作用的研究［J］.
2024年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（7）：901-908 ·903 ·

细 胞 趋 化 蛋 白 1（monocyte chemotactic protein ⁃ 1，
AZM（40 mg/kg）or
MCP⁃1）ELISA Kit（#KE20009，Proteintech公司，美国）。 saline
intraperitoned injection，daily
1.1.3 仪器
HM315 石蜡切片机（Thermo Microm 公司，美 Room air or hyperoxia
P0 P1 P10 P11
国）、生物组织包埋机+冷台（Leica公司，德国）、脱色
图1 实验方案
摇床（江苏南达生物技术开发公司）、光学显微镜
（Olympus 公司，日本）、涡旋振荡器、组织匀浆机 Figure 1 Experimental protocol
（IKA 公司，德国）、高速冷冻离心机（Eppendorf 公 液氮中冷冻，然后放置于-80 ℃冰箱保存，用于qPCR
司，美国）、凝胶成像分析系统（BIO⁃RAD 公司，美 检测。26 只动物在排血完成后，剪开颈部皮肤，分

国）、定量PCR仪⁃7300 Plus系统（Applied Biosystems 离气管周围肌肉组织，暴露气管，利用 24 G 动脉留
公司，美国）。 置针行气管插管，退出针芯，手术线扎紧固定，用

1.2 方法 4%多聚甲醛进行肺组织原位固定后，拔除气管插
1.2.1 造模及分组 管，沿胸骨正中打开胸腔，可见肺组织膨胀，分离出
将SD新生大鼠在生后12 h内随机分为空气⁃生 肺组织和心脏，置于装有 4%多聚甲醛的 EP 管中
理盐水（RA⁃Saline）组 22 只、空气⁃AZM（RA⁃AZM） 4 ℃冰箱放置 24 h，石蜡包埋切片，用于 HE 染色及
组 22 只，氧气组分为氧气⁃生理盐水（O2⁃Saline）组 免疫组化。
23 只、氧气⁃AZM（O2⁃AZM）组 22 只，每组动物雌雄 1.2.3 HE 染色及肺泡平均线性截距（mean linear
比例相同。空气组置于空气环境［吸入氧浓度（fraction intercept，MLI）的测量
of inspirtion O2，FiO2）=21%］，氧气组在出生 12 h 内 将在 4%多聚甲醛中固定 24 h 后的肺组织进
置于自制氧箱内，持续暴露于高氧中，维持 FiO2于 行石蜡包埋。连续切片（厚度 4 μm），放于 60 ℃烤
95%~100%。在生后第 1 天，RA⁃AZM、O2⁃AZM 组每 箱中 6 h。然后进行 HE 染色，树脂封片，光镜下观
日给予大鼠AZM 40 mg/kg 腹腔注射连续10 d，生理 察肺组织形态结构。选取染色良好的肺组织，在
盐水对照组给予等剂量的生理盐水，实验方案如 200 倍放大倍数下拍摄 10 张照片，避开大血管和大
图 1 所示。每组动物在第 11 天进行安乐死并取 气道，使用 CellSens 软件（Olympus 公司，日本）载入
材。所有动物饲养于 SPF 级实验动物房，饲养温度 照片，每张照片载入平均分布的 21 条直线，计数测
为 20~24 ℃，湿度为 50%~60%，自动设置 12 h 明暗 量线末端两点落在肺泡（pulmonary alveoli，PA）里的
交替，仔鼠予母乳喂养，每天空气组母鼠与氧气组 个数 N1、测量线末端两点落在气道（air duct，AD）里
母鼠进行交换以防止母鼠氧气中毒导致母乳量减 的个数 N2、测量线与肺泡间隔（alveolar septum，AS）
少，每天更换垫料及仔鼠称重，及时补充饲料及饮 相交的次数 N3，按照公式 MLI=d×（N1+N2）/N3计算，
用水。 d代表直线长度120 μm ［14］ 。
1.2.2 标本收集 1.2.4 qPCR检测炎症因子的表达
在大鼠生后第 11 天，腹腔注射戊巴比妥钠 使用组织匀浆机将肺组织进行匀浆，分离并提取
（160 mg/kg）进行安乐死，剪开腹腔皮肤，暴露出腹 出RNA，用cDNA合成试剂盒合成cDNA。在Applied
腔动静脉，剪断腹腔动静脉进行排血。排血完成 Biosystems 7300 Plus 系统上进行实时定量 PCR。
后，其中24只鼠打开胸腔，直接取肺组织，迅速置于 β⁃actin用作管家基因。引物列于表1中。

表1 引物序列
Table 1 Sequences of primers

Gene Forward（5’→3’） Reverse（5’→3’）
IL⁃6 ATATGTTCTCAGGGAGATCTTGGAA TGCATCATCGCTGTTCATACAA
CINC⁃1 GCACCCAAACCGAAGTCATA GGGGACACCCTTTAGCATCT
MCP⁃1 ATGCAGTTAATGCCCCAGTCA TTCTCCAGCCGACTCATTGG
PAI⁃1 AGCTGGGCATGACTGACATCT GCTGCTCTTGGTCGGAAAGA
β⁃actin TTCAACACCCCAGCCATGT AGTGGTACGACCAGAGGCATACA
CINC⁃1：cytokine induced neutrophil chemoattractant⁃1；PAI⁃1：plasminogen activiator inhibitor⁃1.