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第41卷第12期 匡 衡，蔡 欣，杨 展，等. 抗鼠疫抗原F1的嵌合抗体制备及特性分析［J］.
2021年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（12）：1753-1758 ·1755 ·

1∶200 开始梯度倍比稀释后加入酶标板，37 ℃孵育 M 1 2
bp
1 h 后洗涤 3 遍，加入 HRP 标记二抗，继续于 37 ℃
2 000
孵育 1 h 后洗涤 3 遍，用 TMB 显色液显色，测定
D（450 nm）值。 1 000
1.2.4.2 竞争性ELISA检测 750
50 ng/孔F1抗原包被酶标板，以1∶2 000浓度加 500
入抗F1抗体孵育1 h，洗涤后，将纯化后的人源化F1 ←353 bp
←322 bp
嵌合抗体从1∶50开始倍比稀释，加入酶标板孵育1 h， 250
PBST 洗涤 5 遍，加入 HRP 标记的抗人 Fc 段抗体孵
育后显色，测定D（450 nm）值。
1.2.4.3 亲和力检测 1：重链；2：轻链；M：DL2000marker。
图1 PCR获得轻重链条带
使用Biacore X100分析仪进行亲和力检测。选
Figure 1 Light and heavy chain obtained by PCR
取CM5芯片，并在芯片上固定F1抗体，将抗F1的嵌
合抗体和抗 F1 鼠源抗体梯度稀释后进样分析。使 M 1 2
bp
用Biacore X100软件分别计算其亲和力。
1.2.4.4 免疫沉淀 2 000
将抗F1抗原嵌合抗体与含有裂解液的F1抗原 ←1 598 bp
混合，于4 ℃下摇床孵育过夜，加入Protein G琼脂糖 1 000
←907 bp
于 4 ℃下摇晃过夜。离心后取沉淀进行 SDS⁃PAGE
凝胶电泳，考马斯染色后切割条带做质谱分析。 500

2 结 果 250

2.1 抗F1抗体轻链、重链真核表达载体的构建
1：轻链质粒；2：重链质粒；M：DL10000marker。
PCR获得4C6杂交瘤细胞中抗F1轻、重链可变
图2 轻重链质粒双酶切条带
区基因，琼脂糖凝胶电泳检测条带大小符合预期， Figure 2 Light and heavy chain plasmid by double en⁃
轻链为300 bp左右，重链为350 bp左右（图1），分别 zyme digestion
将轻、重链可变区基因片段克隆到 pMD⁃18T 载体
中，并转化至Top10感受态细胞，培养并挑取单克隆
测序。分别将抗F1抗体轻链、重链可变区基因与人
源抗体恒定区基因拼接后，全基因合成并克隆进
pMH3 质粒中，质粒双酶切结果显示轻链条带为
1 2
700 bp左右，重链条带为1 400 bp左右，与设计条带
大小相符（图2）。 1：转染细胞培养液；2：对照组培养液。
图3 转染后培养液Dot blot检测
2.2 稳定表达细胞系建立与筛选
Figure 3 Dot blot detection of culture medium after trans⁃
使用电穿孔技术，将轻、重链表达质粒共转入 fection
CHO⁃S 细胞中，转染 48 h 后，取上清进行 Dot blot 与
ELISA 检测。结果表明，转染后的细胞可以表达抗 2.3 抗体表达与纯化
F1 嵌合抗体 IgG，并与酶标板包被的 F1 抗原结合 将3×10 个细胞悬浮培养于30 mL CHOmaxA培
7
（图3）。 养基中，每2 d测定细胞密度。细胞培养15 d后，离
使用G418筛选2周，将细胞挑取2次单克隆，取 心并收集上清进行Dot blot与ELISA检测均为阳性，

上清做Dot blot 检测，挑选目的蛋白表达量最高的6 结果提示，CHMIgG⁃F14C6⁃5 细胞可以于悬浮培养
株单克隆细胞，稳定传代培养 10 代，取上清进行 基中稳定表达抗F1嵌合抗体。
ELISA 检测，挑选表达蛋白量最高的一株命名为 上清经ProteinG 亲和纯化后，得到抗F1嵌合抗
CHMIgG⁃F1C6⁃5，扩大培养进行下一步实验（图4）。 体，加入 PBS 溶液调整浓度为 1 mg/mL。经 SDS⁃