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第44卷第12期 陈梦星，宗慧敏，张 洋. 糖基化基因构建的IgA肾病风险预测模型及免疫细胞浸润分析［J］.
2024年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（12）：1671-1681 ·1673 ·
https：//acgg.asia/ggdb2/）中收集糖基化相关基因。验 1.2.5 免疫细胞浸润分析
证样本集来源于2022年南京医科大学附属南京医院 CIBERSORT 是一种基于线性支持向量回归的
进行肾活检术的15例患者的肾组织石蜡切片和冻存 新型反卷积算法，常用来计算22种浸润免疫细胞的
肾组织，其中5例为IgAN患者，5例为糖尿病肾病患 相对比例和动态调节过程 。采用“CIBERSORT”R
［9］
者，5例为微小病变性肾病患者。该研究已获得医院 包分析IgAN和正常样本中22种免疫细胞浸润程度
伦理委员会批准（KY20231214⁃KS⁃02）。 的差异，绘制小提琴图。同时，利用“ggplot2”R包绘
1.2 方法 制OFG与免疫细胞相关性的热图。
1.2.1 筛选糖基化相关差异表达基因（differential 1.2.6 构建ceRNA网络
expression genes related to glycosylation，DEGRG） 使 用 数 据 库 miRanda（http：//www.micro ⁃ rna.
筛选DEGRG并进行基因本体论（Gene Ontology， org/）、TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）
GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto 和 miRDB（http：//mirdb.org）分别筛选与 OFG 互作的
Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分 miRNA，选择3个数据库都能预测到的miRNA，并从
析。通过“limma”R包分析糖基化相关基因的差异表 SpongeScan 数 据 库（http：//spongescan.rc.ufl.edu）筛
达，依据P < 0.05和|log2FC|≥0.5筛选DEGRG。随后通 选与上述miRNA互作的lncRNA。根据ceRNA理论
过“heatmap”R包绘制前20个DEGRG的热图。利用 构建 lncRNA⁃miRNA⁃mRNA 调控网络，并将结果导
“clusterprofiler”R包进行GO富集分析，Enrichr数据库 入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化。
（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/）进行KEGG分析。 1.2.7 免疫组织化学检测
1.2.2 筛选糖基化相关OFG IgAN、糖尿病肾病和微小病变性肾病患者肾活
本研究采用最小绝对收缩和选择算子（least ab⁃ 检组织石蜡切片脱蜡水化，微波修复抗原，采用SP法
solute shrinkage and selection operator，LASSO）回归， 免疫组化试剂盒，检测指标包括 ST8SIA1（24918⁃1⁃
支持向量机递归特征消除（support vector machine AP，Proteintech公司，美国）、CHSY1（abs148621，上海
recursive feature elimination，SVM⁃RFE）和随机森林 爱必信公司）和PIGH（CSB⁃PA238046，武汉华美生物
（random forest，RF）3种算法筛选糖基化相关特征基因 公司），抗体均为1∶100稀释，DAB显色2~5 min，显微
并取交集得到OFG。使用“glmnet”R包进行LASSO回 镜下观察，控制着色时间，苏木素复染，所有操作按照
归分析，利用“e1071”R包进行SVM⁃RFE算法分析， 说明书进行。采用Image⁃Pro Plus 6.0软件进行半定
并借助“randomforest”R 包构建 RF。取交集的重叠 量分析：通过测量每张图片的累积光密度值（integrated
基因作为 OFG 后，利用“glmnet”R 包构建 Logistic 回 option density，IOD）值以及区域面积（area）值，再计算
归模型，“pROC”R 包绘制受试者工作特征（receiver 出平 均 光 密 度 值（mean density）即 mean density=
operating characteristic，ROC）曲线计算单个 OFG 和 IOD/area。每个样本的 5个随机区域平均光密度的平
总体的曲线下面积（area under the curve，AUC），评 均值即为此样本的值，每组取5个样本，取平均值。
估诊断OFG的价值。 1.2.8 Western blot
1.2.3 构建列线图模型 取冻存的肾活检组织，加适量裂解液后匀浆、
运用“rms”R 包构建基于 OFG 的列线图模型预 离心，取上清液检测蛋白浓度。取等量组织蛋白样
测 IgAN 的发生。研究还绘制校准曲线评估实际曲 本，变性后进行十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电
线和预测曲线的一致性，绘制决策分析曲线评估模 泳（sodium dodecyl sulfate⁃polyacrylamide gel electro⁃
型的预测价值。 phoresis，SDS⁃PAGE），转入聚偏二氟乙烯膜（poly⁃
1.2.4 OFG的功能分析 vinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脱脂牛奶室温封
采用“ClusterProfiler”R 包进行基因集富集分析 闭 1 h，然后分别与特异性抗体 4 ℃孵育过夜（所用
（gene set enrichment analysis，GSEA），以 MSigDB 数 抗体同免疫组织化学检测，1∶500 稀释），TBST 洗
据库（https：//www.gsea⁃msigdb.org/gsea/msigdb）中的 膜，再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育
标志基因集作为背景基因，利用 KEGG 数据库对 2 h，洗膜，ECL化学发光法曝光。以β⁃actin（1∶500）
OFG 进 行 功 能 注 释 。 通 过 GENEMANIA 网 站 作为内参，测定蛋白相对表达水平。
（http：//genemania.org/search/）构建基因⁃基因交互作 1.2.9 Nephroseq v5外部数据库验证
用网络，识别OFG的潜在相互作用。 为 了 进 一 步 验 证 OFG 的 差 异 表 达 ，分 析
