Page 58 - 南京医科大学自然版
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第45卷第12期
               ·1740 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年12月


              量 PCR 检测系统（Roche Diagnostics 公司，瑞士）检              48 h后，用PBS 洗涤细胞，4%多聚甲醛固定30 min，
              测基因表达量。PCR 参数为：95 ℃，30 s；95 ℃ 5 s，                然后用 0.5% Triton X⁃100/PBS 溶液处理 10 min。根
              60 ℃ 20 s，40次循环；65 ℃ 15 s。uc004coz.1上游引           据说明书，用 Apollo 在黑暗中孵育 30 min，然后用
              物：5′⁃TCAACTGCAACTCCAAAGCC⁃3′，下游引物：                Hoechst 染色 30 min，用荧光共聚焦显微镜（蔡司公
              5′⁃GGGGACGAGAAGGGATTTGA⁃3′；β⁃actin上游引             司，德国）采集图像。
              物：5′⁃CACGGTCAGGATCTTCATGAGGTAGT⁃3′，下              1.2.7  Transwell细胞迁移实验
              游引物：5′⁃AGAGCTACGAGCTGCCTGACGGCATC⁃                     实验采用 24 孔 8.0 μm 孔径的小室（康宁公司，
              G⁃3′；引物由苏州金唯智生物科技有限公司合                            美国）。100 nmol/L siRNA 转染细胞24 h后，在上室
              成。所有实验重复 3 次。归一化内参水平后，用公                          接种含 4×10 个细胞的 200 μL 无血清培养基，下室
                                                                            4
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                 ΔΔCT 分析相对表达数据 。                                加入600~800 μL含10%胎牛血清的培养基；37 ℃孵
              式2
              1.2.3 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybrid⁃       育24 h后用棉签轻轻去除膜上表面的细胞，用4%多
              ization，FISH）检测基因的细胞定位                            聚甲醛固定穿膜细胞30 min，室温下用800 μL结晶紫
                  采用 Ribo 荧光原位杂交试剂盒（广州锐博生                       溶液染色15~30 min，最后用倒置荧光显微镜拍照。
                           TM
              物科技有限公司）进行 FISH 检测。HUVEC 在底部                      1.2.8  Western blot实验检测蛋白表达
              有圆形爬片的 24 孔板中培养至密度达 60%~70%，                           6孔板中HUVEC用100 nmol/L siRNA 转染48 h
              PBS 洗涤后在室温下用 4%多聚甲醛固定 10 min。                     后，用添加蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液裂解细胞
              每孔加入预冷的渗透液 1 mL，在 4 ℃下孵育 5 min；                   提取蛋白质。取 20~40 μg 蛋白使用 SDS⁃聚丙烯酰
              PBS洗涤后，每孔加预杂交液200 μL，37 ℃孵育30 min；                胺凝胶（上海雅酶生物）和电泳仪（伯乐公司，美
              每孔加探针杂交液100 μL，37 ℃黑暗孵育过夜；然后                      国）进行分离后，将蛋白转移到 0.2 μm PVDF 膜
              用枸橼酸钠和 PBS 洗涤细胞，加入 DAPI 染色，室温                     上。然后，用 5%脱脂牛奶封闭，与兔抗 Cyclin B1
              孵育10 min；最后使用荧光共聚焦显微镜采集图像。                       （1∶1 000）、Cyclin D1（1∶1 000）、Cyclin E1（1∶1 000，
              1.2.4  CCK⁃8检测细胞增殖                                Cell Signaling 公司，美国）以及 GAPDH（1∶5 000，武
                  使用 CCK⁃8 试剂盒（Dojindo Laboratories 公司，         汉 Proteintech 公司）抗体在 4 ℃孵育过夜。二抗用
              日本）检测细胞增殖。100 nmol/L siRNA 转染 HU⁃                 5%脱脂牛奶稀释，室温孵育1 h。用TBST洗涤缓冲
              VEC 12~24 h 后，在 96 孔板接种 1 000 个/孔 HUVEC           液洗涤3次，每次10 min，使用ECL液（上海天能）曝
             （100 μL细胞悬液）；然后将培养板在培养箱中预培                         光，用自动化学发光图像分析仪检测蛋白的表达水
              养约3~4 h，直到细胞附着在孔上；细胞继续培养0、                        平，使用Image J软件对条带进行灰度分析。
              24、48、72 h 后，分别加入 10 μL/孔 CCK⁃8 溶液，在              1.2.9  RACE克隆uc004coz.1片段全长
              37 ℃培养箱中培养 2~4 h；使用酶标仪测定 450 nm                        提取 HUVEC 的 RNA，反转录为 cDNA，PCR 扩
              处的吸光度。                                            增目的基因表达。接下来进行3′⁃RACE，对RNA进
              1.2.5  流式细胞仪检测细胞周期                                行加尾，反转录为 cDNA，进行 3′⁃RACE 第 1 轮 PCR
                   HUVEC在6孔板中转染48 h后，用胰酶消化贴                     扩增，回收 PCR 产物为模板，进行第 2 轮 PCR，切胶
              壁细胞（约 5×10 个），并用 PBS 洗涤；然后用预冷                     回收目的条带进行 TA 克隆，挑取阳性克隆进行测
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              70%乙醇在-20 ℃下固定细胞24 h以上；最后，使用                      序，确定3′末端序列。随后进行5′⁃RACE，以提取的
              细胞周期和凋亡分析试剂盒（上海碧云天），加入10 μL                       细胞RNA为模板，反转录为cDNA，进行5′⁃RACE第
              RNase A 和 25 μL 丙啶在 37 ℃下处理细胞 30 min；             1轮PCR，并以PCR产物为模板进行第2轮PCR。切

              再次用冷PBS洗涤细胞，使用流式细胞仪（BD FAC⁃                       胶回收目的产物进行 TA 克隆，挑取克隆进行菌液
              SCanto Ⅱ公司，美国）在488 nm处检测红色荧光。                     PCR 选取阳性克隆进行测序，确定 5′末端序列。最
                    TM
              1.2.6  5⁃乙炔基⁃2′⁃脱氧尿嘧啶核苷（5⁃ethynyl⁃2′⁃             后对3′末端序列与5′末端序列与Ensembl数据库中
              deoxyuridine，EdU）检测细胞增殖                           RNA序列和基因组进行比对，得到对应的染色体及
                  采用Cell⁃Light EdU Apollo567体外流式细胞术             位置。引物及相关产品由广州锐博生物科技有限
              试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）进行 EdU 实                         公司设计合成。
              验。将HUVEC以40%~60%的密度接种于含有细胞                        1.3 统计学方法
              爬片的24孔板中孵育过夜。100 nmol/L siRNA转染                        使 用 GraphPad Prism7 软 件 进 行 统 计 分 析 ，
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