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第45卷第3期 钱 力，陈 晨，李 青，等. 线粒体靶向药物Mitochonic acid 5调控线粒体稳态减轻肾脏纤维化的
2025年3月 机制研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（3）：311-318 ·313 ·
公司，美国）；增加过氧化物酶体增殖物激活受体γ Miro1、Mfn2、PGC⁃1α、SOD2、GAPDH。TBST 洗膜后
共 激 活 因 子 ⁃1α（peroxisome⁃proliferator⁃activated 与二抗室温孵育1 h，最后使用ECL发光液在凝胶成
receptor γ coactivator 1⁃α，PGC1⁃α）抗体（Santa Cruz 像系统进行曝光，通过Image⁃J软件分析并用Graph⁃
Biotechnology 公司，美国）；组织蛋白提取试剂盒、 Pad Prism软件作图。
30% 丙 烯 酰 胺（29∶1）、蛋 白 酶 抑 制 剂 混 合 物 1.2.6 小鼠近端肾小管细胞培养
（100X）、ECL发光液、5×双色上样缓冲液（杭州弗德 根据实验目的，将mRTEC细胞随机分为正常对
生物科技公司）；DEPC 水、BCA 蛋白含量检测试剂 照组、MA⁃5组、TGF⁃β组、TGF⁃β+MA⁃5组。将MA⁃5
盒、DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒（南京凯基生 组及 TGF⁃β+MA⁃5 组 mRTEC 提前 1 h 予 10 μmol/L
物公司）；脱脂奶粉（BD Difco公司，美国）；辣根过氧 MA⁃5 预处理，随后将 TGF⁃β组及 TGF⁃β+MA⁃5 组
化物酶标记的鼠、兔二抗（北京中杉金桥生物技术 mRTEC使用5 ng/mL TGF⁃β刺激细胞。
有限公司）。 1.3 统计学方法
1.2 方法 采用SPSS 20.0软件对结果进行分析，定量实验
1.2.1 小鼠分组及UUO模型构建 数据采用均数±标准差（x ± s）表示，使用 Student’s t
将小鼠随机分为 4 组（每组 6 只），分别为对照 检验行两组间比较，使用 ANOVA 单因素方差分析
组、MA⁃5组、UUO组和UUO+MA⁃5组。UUO小鼠模 行多组间比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
型构建按如下步骤进行：用 5%水合氯醛（10 μL/g）
2 结 果
腹腔注射麻醉小鼠，剔除背部毛发。以下手术操作
均在 37 ℃恒温毯进行，于脊柱左侧行一纵行切口， 2.1 MA⁃5减轻UUO小鼠的肾脏纤维化
暴露左侧输尿管和肾脏，将输尿管与周围组织钝性 α⁃SMA和Col1为肾脏纤维化的标志蛋白，如图
分离，用4.0缝线置于肾下极与输尿管上端并结扎， 1A、B 所示，UUO 手术后第 7 天，实验动物肾组织切
在 2 条缝合线之间剪断输尿管，然后将肾脏与输尿 片的MASSON、天狼星红染色以及Col1和α⁃SMA免
管回复原位，逐层缝合。对照组及 MA⁃5 组按照同 疫组化结果显示UUO+MA⁃5组小鼠肾间质纤维化较
样的方式暴露输尿管与肾脏，但不结扎，并将肾脏 UUO组明显减轻。图1C、D分别为Col1和α⁃SMA 的
与输尿管回复原位，逐层缝合。 免疫组化定量统计分析图，UUO+MA⁃5组纤维化程
1.2.2 小鼠干预及处理 度较UUO组明显减轻，差异有统计学意义。实验动
对手术处理后的4组小鼠做如下干预：MA⁃5组 物肾皮质的 Western blot 检测发现 UUO+MA⁃5 组小
和 UUO+MA⁃5 组：手术后第 2 天起予 50 mg/（kg·d） 鼠的α⁃SMA表达较UUO组明显降低，差异有统计学
MA⁃5 灌胃；对照组和 UUO 组：手术后第 2 天起根据 意义（图1E、F）。
体重予相应体积的食用玉米油灌胃。所有小鼠于 2.2 MA⁃5可维持UUO小鼠肾脏线粒体稳态
手术后第7天实施安乐死并收集肾脏和血清标本。 Mitofilin 是维持线粒体内膜嵴形态的关键蛋
1.2.3 Masson及天狼星红染色 白，对于维持线粒体功能非常重要。如图 2A 所示，
肾组织石蜡包埋后切片 2 μm，脱蜡后分别行 在UUO模型中Mitofilin表达减少，而MA⁃5可以提高
Masson和天狼星红染色，光镜下观察小鼠肾组织纤 其表达。Miro1 位于线粒体外膜，可以影响线粒体
维化程度。 的分布和能量供应。如图 2B 所示，在 UUO 模型中
1.2.4 免疫组化染色 Miro1 表达减少，而 MA⁃5 可以上调 Miro1 的表达。
肾组织石蜡包埋后切片3 μm，脱蜡后用柠檬酸 线粒体处于分裂与融合的动态平衡中，Mfn2位于线
盐缓冲液修复抗原，再行α⁃SMA、Col1的免疫组化染 粒体外膜，介导外膜融合。本研究结果表明，在
色，光镜下观察并比较各组间纤维化指标α⁃SMA、 UUO 模型中 Mfn2 表达减少，而 MA⁃5 可以提高其表
Col1表达差异。 达（图2C）。PGC⁃1α是线粒体生物合成和功能的主
1.2.5 Western blot 要调节因子，在UUO模型中PGC⁃1α表达明显降低，
提取各组小鼠肾组织蛋白，使用BCA法测定总 而 MA⁃5 可以提高其表达（图 2D），从而改善线粒体
浓度，然后在 SDS⁃PAGE 凝胶电泳中分离蛋白质样 功能。线粒体基质中的 SOD2 能够清除超氧化合
品并湿转到PVDF膜上，之后脱脂牛奶封闭1 h后与 物，在 UUO 模型中 SOD2 表达减少，而 MA⁃5 可以提
以下蛋白的一抗 4 ℃孵育过夜：α⁃SMA、Mitofilin、 高其表达（图2E）。
