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第45卷第7期 李逸涵，王子文，陈 锐，等. IGF2BP3通过m6A⁃EP300轴介导乳酸化修饰驱动三阴性乳腺
2025年7月 癌代谢与表观遗传交互作用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（7）：905-912 ·907 ·
染蛋白分子量标准及 Western blot 试剂（封闭液、洗 lactyl lysine 及 IGF2BP3 抗体等）及室温 1 h HRP 标
涤液、二抗稀释液等）（南京碧云天生物技术有限公 记的二抗孵育，最终通过ECL化学发光显影系统对
司）；Tris/MOPS/SDS电泳缓冲液、速溶型蛋白上样缓 目的蛋白表达进行显影检测。
冲液（上海雅酶生物医药）；蛋白质常规分子量标 1.2.3 RNA提取与RT⁃qPCR分析
记、IGF2BP3多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公 采用 TRIzol 法提取总 RNA：收集 1×10 个细胞
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司）；anti⁃l⁃lactyl lysine兔源多克隆抗体（杭州景杰生 沉淀，加入 1 mL TRIzol 裂解液冰浴裂解，经氯仿分
物科技）。 层、异丙醇沉淀及 75%乙醇洗涤后，用 30 μL 无
细胞培养相关试剂：DMEM、RPMI1640 培养基 RNase 水溶解 RNA 沉淀，NanoDrop 测定浓度及纯
及高级胎牛血清（南京维森特生物技术有限公司）； 度，分装保存于-80 ℃。逆转录使用 HiScript Q RT
Lipofectamine 3000 转染试剂（赛默飞世尔科技公 SuperMix，取 500 ng RNA 于 37 ℃反应 15 min 合成
司，美国）；一步冻存液（苏州海星生物科技有限公 cDNA。 qPCR 采 用 ChamQ SYBR Master Mix 构 建
司）；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（武汉普诺赛生命科 10 μL 反应体系（含 0.4 μmol/L 正反向引物及 1 μL
技有限公司）。其他试剂：结晶紫染液、DMSO、PBS cDNA模板），在Roche荧光定量PCR仪上运行程序：
等（南京碧云天生物技术有限公司）。 95 ℃预变性30 s；40个循环（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s）；
1.2 方法 95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s→95 ℃ 15 s。以β⁃actin 为内
1.2.1 慢病毒转染 参，通过2 -ΔΔCt 法计算目标基因相对表达量，熔解曲线
采用感染复数（multiplicity of infection，MOI）=10 单峰验证扩增特异性。
进行慢病毒转染实验。将MDA⁃MB⁃231和HCC⁃1806 特异性 PCR 引物如下，IGF2BP3 正向：5′⁃TTG⁃
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细胞按 2×10 个/孔接种于 6 孔板，待贴壁率达 80% CAGGAATTGACGCTGTA⁃3′，反向：5′⁃ACCCAAG⁃
时更换含 10% FBS 的完全培养基。细胞融合度为 GCGTTCAGATTTA⁃3′；β⁃actin 正向：5′⁃TCACCCA⁃
40%~50%时，弃去旧培养基，经 PBS 清洗后加入冰 CACTGTGCCCATCTACGA ⁃ 3′ ，反 向 ：5′ ⁃ CAGCG⁃
上解冻的慢病毒液及 5 μg/mL Polybrene，37 ℃共培 GAACCGCTCATTTGCCAATGG⁃3′；EP300 正向：5'⁃
养 16~24 h。转染后更换新鲜培养基，继续培养 CTCAGCCGGAGGATATTCA⁃3′，反向：5′⁃GACGG⁃
48~72 h，通过荧光显微镜观测荧光蛋白表达（随机 TAAGTGCCTCCCAAA⁃3′。
5 个视野统计阳性率）及细胞形态学变化评估转染 1.2.4 细胞划痕实验
效率。转染 72 h 后采用 5 μg/mL 嘌呤霉素持续筛 将 MDA⁃MB⁃231 和 HCC⁃1806 细胞接种于 6 孔
选 7~10 d。 板，待融合至 80%~90%时，使用无菌移液器尖端划
1.2.2 蛋白质印迹分析（Western blot实验） 出均一划痕（宽度200~500 μm），PBS轻柔冲洗去除
根据目标蛋白分子量范围配制不同浓度分离 脱落细胞后更换无血清培养基以抑制增殖。分别
胶（5%胶适用于50~150 kDa，7%胶分离30~90 kDa， 于0、24 h在倒置显微镜下采集图像（固定放大倍率
10%胶适配20~80 kDa），采用1.5 mm 玻璃板制胶模 及光照条件），采用Image J软件量化划痕宽度，按公
具，注入分离胶后以无水乙醇压胶形成平整界面， 式计算迁移率：迁移率（%）=（初始宽度-终点宽度）/
室温聚合后灌注5%浓缩胶并插入上样梳。待胶体 初始宽度×100%。每组设 3 个技术重复，独立实验
完全固化后，将凝胶垂直安装至电泳槽，加入 1×电 重复3次，确保数据可靠性。
泳缓冲液，以 80 V 恒压进行电泳，待样品迁移至浓 1.2.5 CCK⁃8细胞增殖检测
缩胶底部后调整电压至 120 V，通过预染蛋白分子 将MDA⁃MB⁃231和HCC⁃1806细胞以3×10 个/孔
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量标准品（10~180 kDa）监控迁移进程，当目标条带 接种于 96 孔板，设置空白对照（无细胞培养基）及
接近分离胶下 1/3 时终止电泳。转膜前将 PVDF 膜 实验组（含梯度浓度处理药物），每组设 3 个复孔。
经甲醇活化10 s，与凝胶、滤纸及海绵垫按“阴极板⁃ 37 ℃培养 24 h 后，弃去原培养基，每孔加入含 10%
海绵⁃3 层滤纸⁃凝胶⁃膜⁃3层滤纸⁃海绵⁃阳极板”顺序 CCK⁃8 试剂的无血清培养基 100 μL，避光孵育 2 h。
组装转膜夹，全程使用玻璃棒排除气泡。转膜槽置于 使用酶标仪于 450 nm 波长测定吸光度值（OD 值），
冰水浴中，以400 mA恒流转膜30 min（50~100 kDa蛋 按公式计算细胞存活率：存活率（%）=（实验组
白）至60 min（>100 kDa蛋白）。转膜结束后，依次进 OD-空白组 OD）/（对照组 OD-空白组 OD）×100%。
行 2 h 5%脱脂牛奶封闭、4 ℃过夜一抗孵育（anti⁃l⁃ 每组实验独立重复 3 次。
