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第45卷第8期      郭 爽，倪    曼，程 丽，等. 烟酸通过SIRT3/SOD2通路改善老龄小鼠体外成熟的卵母细胞质量［J］.
                  2025年8月                  南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（8）：1101-1109，1177                    ·1103 ·


                1.2.2 卵母细胞获取和IVM                                  用共聚焦显微镜进行拍照。每组实验使用10~20枚
                    雌性小鼠腹腔注射10 U孕马血清促性腺激素，                        卵母细胞，所有实验均重复3次。
                48 h 后处死，收集两侧卵巢中生发泡（germinal vesi⁃                1.2.7 卵母细胞线粒体追踪和荧光标记NA检测
                cle，GV）期卵丘⁃卵母细胞复合体（cumulus⁃oocyte                     使用Mito⁃Tracker Red标记卵母细胞线粒体，并
                complex，COC），置于M2培养基37 ℃、5%CO2培养箱                 与荧光标记的 NA 共孵育 14~16 h。将 M Ⅱ期 COC
                中培养14~16 h，使其进入减数分裂Ⅱ（meiosis Ⅱ，M                  脱颗粒后，置于100 μmol/L 的Mito⁃tracker 工作液和
                Ⅱ）期。然后用透明质酸酶将颗粒细胞脱颗粒，观                            200 μmol/L荧光标记的NA中，置于37 ℃、5% CO2的
                察第一极体排出（the first ploar body extrusion，PBE）       温箱中避光孵育 30 min。共聚焦显微镜拍摄，使用
                率，并收集卵母细胞用于后续实验。每组实验使用                            Image J 软件进行半定量分析。每组实验使用 10~
                10~20枚卵母细胞，所有实验均重复3次。                             20 枚卵母细胞，所有实验均重复3次。
                1.2.3 体外受精和胚胎培养                                   1.2.8 ATP测定
                    采用C57BL/6J雄性小鼠，处死后获取的精子在                          使用增强型 ATP 检测试剂盒检测卵母细胞中

                精子获能液中进行 1 h 获能。同时，将 MⅡ期 COC                      ATP含量。每组收集20枚MⅡ期卵母细胞于10 μL
                在 HTF 培养液中清洗 3 次，随后与获能精子在 HTF                     裂解液中，校正每组终体积为20 μL。根据说明书，
                培养液中共孵育4 h。完成受精后，将受精卵转移至                          制备标准品、工作液。预先向 1.5 mL EP 管中加入
                胚胎培养液中，清洗并继续培养。受精后24 h观察                          100 μL 工作液，室温静置 5 min 以淬灭底物 ATP。
                二细胞期，受精96 h后观察囊胚期。每组实验使用                          随后每组加入 20 μL 待测样品或标准品，使用化学
                20~30枚卵母细胞，所有实验均重复3次。                             发光检测仪连续测定相对荧光素酶活性值，并计算
                1.2.4 卵母细胞免疫荧光检测                                  ATP绝对浓度值。
                    将MⅡ期卵母细胞经过脱颗粒处理后，采用4%                         1.2.9 免疫印迹分析
                多聚甲醛溶液在常温条件下固定 30 min，随后使用                            每组均收集约 180 枚 MⅡ期卵母细胞，加入
                0.5%聚乙烯醇溶液反复洗涤 3 次。接着将样本转                         RIPA裂解液冰上充分裂解30 min，加入缓冲液并煮
                移至 0.5% Triton X⁃100 溶液中，在室温环境下进行                 沸 5 min。通过 10%SDS⁃PAGE 凝胶分离并转移至
                20 min破膜处理。随后，用封闭液常温下封闭 1 h。                      PVDF 膜上。室温下用 5%脱脂牛奶封闭 1 h，一抗
                处理后的卵母细胞分别置于相应的一抗（荧光标记                           （SIRT3 抗体、SOD2 抗体和 Ac⁃SOD2 抗体）孵育过
                的花生凝集素抗体和α⁃Tublin 抗体）溶液中，在4 ℃                     夜。随后与相应的二抗孵育 1 h。通过化学发光法
                条件下孵育过夜。清洗后，在避光条件下室温孵育                            检测蛋白条带。使用 Image J 定量条带强度，以α⁃
                二抗 1 h。采用DAPI对细胞核进行染色后封片。使                        Tubulin为内参，用于定量每种蛋白的相对表达水平。
                用尼康激光共聚焦显微镜进行图像采集，并运用                             1.3  统计学方法
                Image J软件进行定量分析。每组实验使用 30 枚卵                          使用 GraphPad Prism 9 软件分析数据，使用独
                母细胞，所有实验均重复 3 次。                                  立样本 t 检验分析两组之间的差异，使用单因素
                1.2.5 卵母细胞内ROS及线粒体ROS检测                           ANOVA 检验分析多组的差异。P < 0.05 为差异有
                    使用二氢乙啶（dihydroethidium，DHE）检测卵                统计学意义。
                母细胞内ROS水平，使用Mito⁃SOX Red检测线粒体
                                                                  2  结 果
                ROS 水平。使用 M2 培养液，稀释 DHE 终浓度为
                100 μmol/L 工作液，稀释 Mito⁃SOX Red 为终浓度               2.1  确定NA体外培养的最适作用浓度
                200 μmol/L 的工作液。将 MⅡ期卵母细胞脱颗粒                          为筛选 NA 干预的最适作用浓度，取老龄小鼠
                后，置于上述工作液中，在37 ℃、5% CO2的温箱中避                      的GV期COC进行IVM培养。在基础培养体系中分
                光孵育 30 min。每组实验使用 10~20 枚卵母细胞，                    别添加0（对照组）、100、200、300 μmol/L NA，持续培
                所有实验均重复3次。                                        养 16 h 后评估胚胎发育潜能。实验数据显示，尽管
                1.2.6 卵母细胞线粒体膜电位检测                                老龄+200 μmol/L NA组卵母细胞的二细胞率较老龄
                    使用 JC⁃1 检测 MⅡ期卵母细胞线粒体膜电                       组有所提升，但组间差异没有统计学意义（P > 0.05，
                位。根据说明书，使用M2培养液稀释JC⁃1工作液至                         图1A、B）。进一步比较囊胚形成率发现，老龄组卵
                200 μmol/L，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育30 min，使              母细胞的囊胚形成率显著低于年轻对照组，在 NA
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