Page 32 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2025年第9期
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第45卷第9期
·1244 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2025年9月
准（批号：2021DZGZR⁃YBB⁃096）。 表1 宿主基因甲基化检测的引物序列
1.2.2 DNA提取与亚硫酸氢盐转化 Table 1 Primer sequences for host gene methylation
使用 QIAamp DNA Mini Kit 提取宫颈脱落细 Gene Primer Sequence（5′→3′）
胞中的基因组 DNA，取 DNA 浓度在 5 ng/μL 以上 DLX1 F GTAGGAATGGTTTTTGGTAGATAGAG
且 D（260 nm）/D（280 nm）比值为1.6~2.2的样本，使 R AAAATAACCCCTCCCCAAACT
S GGGATTTTTTAGGTTTTTAGAATAG
用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit 对提取的DNA进行
ZNF671 F GGAGTAGGAGAAAGGGTGATTGA
亚硫酸氢盐转化和纯化。
R ACATTTTATTTCTATCAAACTATCCCTAAC
1.2.3 DNA甲基化水平检测
S GTTAGGAGGAAGTAGTATTTAT
使用 MethMarkerDB 网站 ［17］ 识别宿主基因的差 JAM3 F AGGGTTTTGGTAGGTTGG
异甲基化区域，并利用PyroMark Assay Design 2.0针 R CCCCAAACCCTAATCTCCCA
对上述区域的 CpG 位点设计 PCR 扩增和焦磷酸测 S GTTGTAGTTGGTTTTTTAGTAATTT
序引物，序列如表 1 所示。以纯化后的亚硫酸氢 SOX1 F GGTTTTTTTAGGGTATTTGGGATTAGTA
盐转化 DNA 为模板，使用 GoTaq 热启动酶分别对 R ACCTCCAACTCCAAAACTACAACTTCT
®
4 个基因的目标区域进行 PCR 扩增。扩增体系为 S GGGTATTTGGGATTAGTATA
10 × Buffer 10.00 μL，MgCl2 （25 mmol/L）4.00 μL， F：forward primer；R：reverse primer；S：pyrosequencing primer.
dNTPs（10.00 mmol/L）1.00 μL，GoTaq 热 启 动 酶 归为高风险组，即 CIN2+。该分组方式符合宫颈癌
®
0.25 μL，上、下游引物各 0.50 μL，并补充蒸馏水至 前病变的临床分流标准，广泛用于评估筛查方法在
50.00 μL，其中 ZNF671 将引物投入量改为 1.00 μL。 分流CIN2+中的效能。
SOX1、ZNF671、DLX1 的扩增条件为 95 ℃预变性 1.3 统计学方法
3 min，40 个循环（95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）， 本研究采用 R 4.4.1 进行数据分析，并利用
72 ℃ 完全延伸 7 min；JAM3 的扩增条件为 95 ℃预 GraphPad Prism 10、SPSS 26.0、Medcalc 23 进行补充
变性 3 min，45 个循环（95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 统计。所有统计检验均为双侧检验，P < 0.05 表示
30 s），72 ℃ 完全延伸 7 min。将 PCR 扩增产物作为 差异有统计学意义。
焦磷酸测序的模板，并进行①单链制备：在8连管中 1.3.1 甲基化水平分析
分别加入 55 μL 已配制好的链霉亲和素修饰的微 多组间差异分析（正常/低级别组织学/高级别
球溶液，再分别加入20 μL PCR扩增产物，震荡混匀 组织学/癌症）：采用Shapiro⁃Wilk检验或Kolmogorov⁃
7 min；②平板加样：在焦磷酸测序专用的24孔板上 Smirnov检验评估每组数据正态性，Levene检验用于
加入 1 μL 测序引物和 24 μL Annealing Buffer；③引 评估方差齐性。若数据符合正态分布且方差齐，采
物退火与杂交：打开真空泵，把针头先在干净超纯 用单因素方差分析进行总体差异检验，事后两两比
水中洗涤，再将制备好的单链吸在针头上，经乙醇洗 较采用 Tukey HSD 检验；若数据不符合正态分布或
去残余核酸 5 s、NaOH 变性 5 s、Washing Buffer 10 s 方差不齐，使用Kruskal⁃Wallis H检验，两两比较采用
后吸走所有液体，关闭抽真空阀门，与平板中的引 Dunn检验，并选择Benjamini⁃Hochberg校正来控制假
物和 Annealing buffer 混匀，87 ℃变性 1 min 后，冷却 发现率，确定差异的具体组别。采用 Jonckheere⁃
至室温，使模板与引物退火杂交；④加试剂仓，并将 Terpstra 趋势检验评估甲基化水平是否随疾病进展
其和24孔板放入Q24并运行，PyroMark Q24 2.0.6自 呈单调变化趋势。
动计算每个CpG位点的甲基化水平。 二分类分析（CIN1-/CIN2+）：进行正态性检验，
1.2.4 研究结局定义 正态分布变量采用独立样本 t 检验，非正态分布变
根据阴道镜引导下活检的组织学结果，将患者 量采用 Mann⁃Whitney U 检验进行两组差异比较。
分为4组：①正常组（无病变或炎症）；②低级别组织 通过箱线图展示 4 个基因的甲基化水平分布，并进
学组（CIN1）；③高级别组织学组［CIN2、CIN3 和原 行受试者工作特征（receiver operating characteristic，
位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）］；④癌症组（宫 ROC）曲线分析，评估其作为单个生物标志物时的
颈癌，包括鳞状细胞癌和腺癌）。本研究的主要结 ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）、敏感
局是CIN2+。将患者分为两组：正常或CIN1者归为 度、特异度、准确度（accuracy，ACC）、阳性预测值
低风险组，即CIN1-；CIN2、CIN3、AIS或宫颈癌患者 （positive predictive value，PPV）、阴性预测值（negative
