Page 59 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2025年第9期
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第45卷第9期          杨继辰，邱 玲，林建国. 监测免疫治疗反应的颗粒酶B靶向分子影像探针研究进展［J］.
                  2025年9月                     南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（9）：1267-1275                      ·1271 ·


                PD⁃L1 抗体药物的 GNR 可有效抑制 PD⁃1 与 PD⁃L1                联合治疗的CT26荷瘤鼠模型中进行G⁃SNAT⁃Cy5的
                之间的相互作用，并诱导活化T细胞介导的GzmB释                          NIRF 成像，显示经过 ICI 的联合治疗后引发了异质
                放，从而激活探针进行 NIRF 成像。在不同的荷瘤                         性反应，在治疗终点时治疗应答的小鼠肿瘤体积明
                小鼠模型中利用 GNR 对免疫治疗反应进行实时监                          显缩小，而治疗无应答的小鼠以及未治疗的小鼠肿
                测，结果显示治疗应答的 MC38 荷瘤鼠肿瘤中荧光                         瘤则持续生长。由此可见，G⁃SNAT⁃Cy5成像能够监
                信号明显“开启”并显著增强，而在治疗未应答的                            测肿瘤对 ICI 治疗的反应，在免疫治疗早期区分应
                B16⁃F10 荷瘤鼠肿瘤中未检测到荧光信号，说明                         答者与无应答者，为其在临床应用中的发展奠定了
                GNR 能够有效区分高反应性和低反应性肿瘤。这                           基础。
                些结果证实了 GNR 作为一个极具潜力的 NIRF 探                           Xu 等 ［22］ 利用 CBT⁃Cys 点击缩合自组装策略制
                针，能够对免疫治疗反应进行无创、灵敏成像。                             备了双淬灭的NIRF探针Cys（StBu）⁃Ile⁃Glu⁃Phe⁃Asp
                    He 等 ［44］ 通过将 GzmB 特异性识别肽 IEFD 和             （IEFD）⁃Lys（Cy5.5）⁃CBT，命名为Cy5.5⁃CBT，用于特

                IEPD 分别与花菁染料 CyOH 和对氨基苯甲醇（p⁃                      异性检测 GzmB 活性。与 G⁃SNAT⁃Cy5 不同，Cy5.5⁃
                aminobenzyl alcohol，PABA）连接，成功构建了处于               CBT 通过二硫键的体外还原产生环状二聚体，导致
                荧光淬灭状态的 NIRF 探针 CyGbPF 和 CyGbPP。当                 单次信号淬灭，随后借助分子间疏水和π⁃π堆叠自
                GzmB 将底物序列 IEFD 和 IEPD 剪切后，PABA 基团                组装成纳米聚集体 Cy5.5⁃CBT⁃NPs，荧光信号进一
                的离去使得淬灭的荧光信号重新“开启”。此外，探                           步产生“双淬灭”。Cy5.5⁃CBT⁃NPs 在体外保持着这
                针的被动靶向肿瘤能力，使其能够实时检测免疫治                            种极低荧光强度的双淬灭状态，而当探针内吞进入
                疗后肿瘤中的 GzmB 表达水平，从而评估免疫治疗                         肿瘤细胞后，通过 GzmB 对 IEFD 序列的裂解，可使
                期间的免疫激活状态及治疗反应。在4T1荷瘤鼠模                           纳米颗粒解组装并激活荧光，从而实现对肿瘤中
                型中，研究者评估了 CyGbPF和 CyGbPP在体内实时                     GzmB 活性的 NIRF 成像监测。免疫荧光染色实验
                监测 GzmB 表达的能力，分别使用 NLG919、R848、                   证实，开启的 NIRF 信号与 CTL 的肿瘤内浸润和
                BMS⁃1、Pexidartinib 和 BEC 5 种免疫治疗药物来激              GzmB 表达水平具有正相关性。此外，进一步的体
                活免疫应答，NIRF 成像定量结果显示，各组肿瘤区                         内成像研究显示，Cy5.5⁃CBT⁃NPs 能够对 BEC 治疗
                域的荧光信号随时间的推移逐渐增强，并在探针注                            后的黑色素瘤 B16⁃OVA 荷瘤鼠模型体内 CTL 的活
                射后6 h达到峰值。免疫荧光和流式细胞术分析也                           性进行 NIRF 成像，以识别治疗应答的肿瘤。这些
                证实了探针的荧光信号强度与其他免疫相关生物标                            研究表明，Cy5.5⁃CBT⁃NPs可用于监测免疫治疗期间
                                                                  TME中GzmB的活性，从而有效评估免疫治疗反应。
                志物如CD8、CD4受体具有正相关性。此外，CyGbPF
                和 CyGbPP在 24 h 内探针的肾脏排泄量占注射剂量                     2.3  荧 光 共 振 能 量 转 移（fluorescence resonance
                的60%，如此高的肾脏清除率为免疫激活的光学尿                           energy transfer，FRET）探针
                液分析提供了可能性。因此，CyGbPF和CyGbPP有望                          Scott等 构建了一系列FRET六肽探针H1 ⁃ H7，
                                                                            ［46］
                成为首类能够实时成像免疫治疗相关生物标志物                             其中探针 H5 表现出卓越的反应活性和催化效率。
                并实现活体动物尿液分析的 NIRF 探针，对于推动                         通过酶促反应速率测试对比发现，六肽探针 H5
                荧光成像技术在免疫治疗监测中的应用具有重要                            （IEPDAL）与人 GzmB 的反应速度显著快于短四肽
                意义。                                               IEPD，在30 min内即可快速完成反应，其kcat/Km值为

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                2.2  NIRF自组装探针                                    1.2×10 L/（mol·s），比先前报道的荧光四肽Ac⁃IEPD⁃
                    基于能够靶向原位配体聚集的多功能骨架                            AMC、CyGbPF以及本次工作中合成的 FRET 四肽 T1
                TESLA，Xie 等 ［45］ 设计了新型 GzmB 激活的自组装                等提高了 1 000 倍以上      ［44，46-47］ 。此外，探针 H5 对人
                小分子 G⁃SNAT，其中包含 GzmB 底物 IEFD，并通过                  GzmB的检测限低至6 pmol/L，显示出极高的选择性
                偶联花青素5（cyanine5，Cy5）得到灵敏的NIRF探针                   和特异性。在 CD8 T 细胞与乳腺癌 E0771 细胞的
                                                                                   +
                G⁃SNAT⁃Cy5。当 GzmB 识别剪切 IEFD 并被肿瘤微                 共培养体系中，探针 H5 的荧光信号能够特异性地
                环境中丰富的 GSH 还原后，Cys 与芳香腈反应生成                       聚集在免疫介导杀伤的癌细胞中，其荧光信号的强
                分子内环化产物，随后在疏水和π⁃π相互作用的促                           弱差异能够反映免疫介导的肿瘤细胞杀伤效果，由
                进下自组装成纳米聚集体，使荧光信号得以聚集增                            此证明该探针为免疫治疗反应的评估提供了一种

                强并实现 GzmB 活性成像。在抗 PD⁃1 和抗 CTLA⁃4                  有力工具。研究进一步发现，探针H5对小鼠GzmB
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