Page 18 - 南京医科大学自然科学版第1期
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第41卷第1期
               · 12  ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年1月


                  终末期肾病（end stage renal disease，ESKD）已          步骤，诱导过程如下：①诱导起始日（D0），当 hP⁃
              成为全球范围内严重的健康问题，每年约有 260 万                         SC 细胞汇合度达到 50%时，启动分化程序，将
              ESKD患者需要透析或肾移植，其中220万患者因无                         Nuwacell TM  Nova hPSC 培 养 基 吸 除 ，加 入 500 μL
                              ［1］
              法医治而过早死亡 。由于肾移植供体不足，长期透                           DPBS（不含钙镁）洗涤细胞1次，随后加入 0.5 mL/孔
                                           ［2］
              析的成年患者平均寿命仅为10年 。因此，迫切需要                          分化完全培养基 A。每天更换培养基，培养 4 d
              阻止慢性肾脏疾病向ESKD进展的治疗。考虑到肾                           （D0~D4）。②第4天（D4），吸除分化完全培养基 A，
              脏疾病可能由遗传异常引起，所以需要更全面地了解                           以 1 mL/孔加入分化完全培养基 B，每天换液，培养
              人类肾脏的发育，尽管动物模型可以提供关于发育机                           2 d（D4~D6）。③第6天（D6），吸除分化完全培养基
              制的信息，但不能准确反映由同源基因突变引起的人                           B，按照 1 mL/孔加入分化完全培养基 C，培 养 2 d
                         ［3］
              类肾脏疾病 。人多能干细胞（human pluripotent                   （D6~D8）。④第 8 天（D8），转 3D 培养：提前配制好
              stem cell，hPSC）由于其扩增性及对发育信号的可塑                    6 mL 分化完全培养基 D，并加入 10 μmol/L Nu⁃
              性，可以诱导分化成肾脏细胞从而模拟人类遗传肾脏                           wacell Blebbistatin，向 24 孔板的1个孔中加入 500 μL
                                                                      TM
              疾病的发病过程        ［4-6］ ，为准确了解肾脏发育过程和肾               0.25% Trypsin EDTA，37 ℃孵育 3 min 后加入 500 μL
              脏疾病发病机制并最终治疗ESKD提供了新的思路                           Trypsin Inhibitor 终止消化，使用 1 mL 移液器轻柔
              和手段。本实验利用hPSC在体外构建类肾体，并通                          吹打，随后将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管，掌上离
              过类肾体在小鼠肾包膜下移植，证实用hPSC诱导类                          心机瞬时离心5~10 s，吸弃上清。加入含 10 μmol/L
              肾，具有肾脏早期的特征结构，可在小鼠体内环境下                           Nuwacell Blebbistatin 的分化完全培养基 D 重悬细
                                                                        TM
              进一步血管化。                                           胞并转移至 poly⁃HEMA 包被的 T25 培养瓶中，置于
                                                                三维摇床，15 r/min 培养。每天换液（D8~D10）。⑤第
              1  材料和方法
                                                                10天（D10），吸除分化完全培养基 D，按照 6 mL/孔加
              1.1  材料                                           入 分 化 完 全 培 养 基 C，连 续 培 养 3 d，每 天 换 液
                  Nuwacell 科研级 HiPSC 细胞株购自安徽中盛                  （D10~D13）。⑥第13天（D13），吸除分化完全培养基
                          TM
              溯源生物科技有限公司，健康4~6周SCID小鼠购自                         C，按照 5 mL/孔加入 Nephron分化培养基E，每天换
              北京维通利华公司，小鼠购买后于山东大学动物实                            液，约 2~4 d可获得类肾（D13~D15/17）。
              验中心SPF级饲养，本研究经医院伦理委员会批准。                          1.2.2 类肾免疫荧光检测
                  hPSC诱导类肾试剂：Nuwacell Nova hPSC培养                    类肾冰冻切片使用DPBS洗1遍，5 min；4%多聚
                                            TM
                         TM
              基、Nuwacell hPSC来源肾上皮细胞分化试剂盒、Nu⁃                   甲醛室温固定 10 min，DPBS 洗 3 遍，每遍 5 min；向
              wacell EDTA 传代工作液、Nuwacell Blebbistatin、          切片中加入1% Triton X⁃100（溶于DPBS 中）室温通
                                               TM
                   TM
              Nuwacell hPSC 冻存液、Nuwacell Solase 细胞消化            透 1 h；DPBS洗3遍，每遍 5 min；使用 10%山羊血清
                      TM
                                            TM
              液、0.25% Trypsin⁃EDTA 和Trypsin inhibitor（安徽中       室温封闭 1 h；用封闭液按 1∶100 稀释一抗；移除封
              盛溯源生物科技有限公司），Matrigel（Corning公司，美                 闭液，加入一抗 CDH1、PODXL 和 LTL 抗体，4 ℃孵
              国），DMEM/F12培养基、DPBS、24孔板和T25培养瓶                   育过夜；移除一抗，DPBS 洗 3 遍，每遍 5 min；使
             （Thermo Scientific 公司，美国），poly⁃HEMA（Sigma公         用 封 闭 液 按 1∶1 000 稀释二抗 Donkey Anti⁃Goat
              司，美国）。类肾鉴定用试剂：多聚甲醛、Triton X⁃                      IgG（594）、Donkey Anti⁃Rabbit IgG（488），避光加入
              100、Fluoroshield TM  with DAPI（Sigma 公司，美国），      二抗，室温孵育1 h；移除二抗，用DPBS洗2遍，每遍
              CDH1、LTL、PODXL和内皮细胞抗原⁃32（MECA⁃32）                 5 min，避光；向切片中加入适量 Fluoroshield with
                                                                                                         TM
              抗 体（Abcam 公 司 ，美 国），Donkey Anti ⁃ Goat IgG        DAPI，荧光显微镜下观察染色情况。
             （594）、Donkey Anti⁃Rabbit IgG（488）（Life Technology  1.2.3 类肾的电镜观察
                                                                                                       3
              公司，美国）。1200型号透射电镜（transmission elec⁃                   类肾诱导的第 15 天（D15），取约 1 mm 类肾样
              tron microscopy，TEM）和LKB⁃V半薄切片机（日本电               品若干块，分别迅速置入盛有 3%戊二醛固定液的
              子公司，日本）；荧光倒置显微镜（Nikon 公司，日本）。                     小瓶中，常规浸洗、1%锷酸固定、磷酸缓冲液漂洗、

              1.2  方法                                           梯度脱水、Epon812 包埋，半薄切片定位，制备超薄
              1.2.1 类肾的诱导                                       切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重电子染色后，
                  按Nuwacell hPSC来源肾上皮细胞分化试剂盒                    用透射电镜观察。
                            TM
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