Page 23 - 南京医科大学自然科学版第1期
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第41卷第1期       王   燕，田   薇，章建国，等. RNA干扰Geminin基因表达对脑胶质瘤恶性生物学行为的影响［J］.
                  2021年1月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：016-021                       · 17  ·


                                                     ［2］
                定程度的进展，但患者的预后仍然不理想 。Gemi⁃                         131 bp。PCR 扩增通过以下条件进行，95 ℃ 5 min，
                nin作为一种小分子蛋白，在细胞周期调控中发挥关                          然后95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环。最
                键作用，可高表达于多种恶性肿瘤，发挥调节肿瘤                            终结果用2    -ΔΔCt 法进行计算。所有实验独立重复3次。
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                细胞增殖分化的作用 ，但其在脑胶质瘤发生、发展                           1.2.2 细胞培养和转染
                中所扮演的角色以及具体的作用机制目前还不清                                 人脑胶质瘤 U251 细胞在 37 ℃、5%CO2、95%
                楚。本研究旨在通过基因沉默技术利用siRNA敲除                          饱 和 湿 度 的 培 养 箱 中 用 含 有 10% FBS、链 霉 素
                Geminin 在人胶质瘤细胞 U251 中的表达，探究其对                   （100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的 RPMI1640 细
                胶质瘤细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响，初步探                           胞培养基传代培养。后续的实验研究取处于对数
                索可能的发生机制，为明确其是否可以作为胶质瘤                            生长期的细胞。Geminin 特异性 siRNA 序列为：（上
                治疗的新作用靶点提供依据。                                     游）5′⁃GGUCCUGAAGCCAAUGAAA⁃3′，（下游）5′⁃
                                                                  UUUCAUUGGUTTUAGGAUU⁃3′；阴性 siRNA 序列
                1  材料和方法
                                                                  为：（上游）5′⁃CGGCT⁃TCGCGGGCGACGGA⁃3′，（下
                1.1  材料                                           游）5′⁃GAGGAGCTGGAAGCAGCCG⁃3′；后续实验共
                    收集 2018—2019 年南通大学附属医院 20 例患                  设置有 3 组：空白对照组（Control）、阴性对照组（si⁃

                者（男 12 例，女 8 例；年龄 27~74 岁，平均年龄 51.5               NC）和干扰组（si⁃Geminin）。当U251细胞生长至融
                岁，中位年龄 48 岁）术后新鲜脑胶质瘤组织和瘤旁                         合度达约50%时，利用脂质体转染法（参照说明书），
                正常脑组织的标本，所有参与实验的患者术前均未                            将Geminin 特异性siRNA 序列及阴性序列分别转染
                接受任何放化疗等抗肿瘤治疗，其临床病理资料和                            至U251细胞，然后用qPCR法检测细胞转染的效率。
                随访记录均完整。本实验经南通大学附属医院伦                             1.2.3 CCK⁃8法检测细胞增殖情况
                理委员会批准，知情同意书齐全，均由患者或其家                                siRNA 转染 24 h 后，将细胞消化，然后在 96 孔
                属签署。人胶质瘤 U251 细胞株购自中国科学院上                         板中以1×10 个/孔的密度在CO2培养箱中培养。每
                                                                             4
                海细胞研究所。胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco 公                      隔24 h通过CCK⁃8试剂盒测量细胞活性，每次检测
                司；Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂购自美国                  之前，将 CCK⁃8 试剂加入板中后在培养箱中培养
                               TM
                Invitrogen 公司；qRT⁃PCR 试剂盒购自美国 Promega             1.5 h。最后测定450 nm波长下分析光密度，并绘制
                公司；Cell Counting Kit⁃8（CCK⁃8）试剂盒购自上海              细胞增殖曲线。所有实验独立重复3次。
                BestBio 公司；抗 HBO1、Cdt1、GAPDH 抗体及二抗均               1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移情况
                购自美国 Abcam 公司；siRNA 片段购自上海晶赛公                         利用Transwell 小室测定U251 细胞的侵袭与迁
                司；其余试剂为国产分析纯。                                     移能力。将熔融过夜的 100 μL Matrigel 添加到 24
                1.2  方法                                           孔板的 Transwell 小室上室中，均匀摇晃，并置于
                1.2.1  GEPIA数据库及qRT⁃PCR分析Geminin在脑                37 ℃的 CO2培养箱中 4~6 h，以形成凝胶。然后将
                胶质瘤中的表达                                           500 μL 无血清培养液加入到下室中，并且将底物膜
                    为了获得 Geminin 在神经胶质瘤中的表达模                      水合30 min。将转染后48 h的U251 细胞以1×10 个/
                                                                                                             5
                式，我们利用来自基因表达谱数据动态分析（gene                          孔的密度转接至涂有基质的 Transwell 上室中，将
                expression profilling interactive analysis，GEPIA）数据  500 μL 全培养液加入下腔室中，过夜后，移开小腔
                库（http：//gepia.cancer⁃pku.cn/）的数据进行分析。另           室，并用棉签擦拭上腔室中剩余的细胞。PBS 清洗
                外使用 qRT⁃PCR 方法检测 20 例人新鲜胶质瘤组织                     后，4％多聚甲醛固定 30 min；0.1％的结晶紫染色
                中 Geminin 的表达情况，具体方法如下：TRIzol 提取                  20 min，PBS 清洗，在显微镜下随机选择 5 个视野进
                胶质瘤组织中的总 RNA，然后按逆转录试剂盒及                           行观察和计数。迁移实验类似，采用Transwell 腔室
                qRT⁃PCR 试剂盒说明操作，Geminin 特异性引物序                    代替基质涂层腔室，进行细胞迁移能力测定。所有
                列：（上游）5′⁃AGAAAATGAGCTGTCCGCAGG⁃3′；                实验独立重复3次。
               （下游）5′⁃TACAGCGCCTTTCTCCGTTT⁃3′，产物大小                1.2.5  蛋白质印迹法检测干扰后 Geminin、HBO1、
                213 bp；以GAPDH作为内对照，其特异性引物序列：                      Cdt1的蛋白表达水平
               （上游）5′⁃GAAGGTCGGAGTCAACGGAT⁃3′；（下游）                    转染48 h后，分别收集3组细胞，按试剂盒说明
                5′ ⁃ TCCCGTTCTCAGCCATGTAGTT ⁃ 3′ ，产 物 大 小         操作，裂解细胞，提取蛋白质，测定蛋白浓度；然后
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