Page 15 - 南京医科大学自然科学版第1期

第41卷第1期 张 敏，姚 俊，鲁雅洁，等. GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立［J］.
2021年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：004-010 · 9 ·

M 1 2 3 4 5 6 在人类家系中首次关联了GPRASP2基因突变/功能
T7EN1酶 - + - + - +
缺陷与SHL的发生相关 。
［3］
为精确模拟GPRASP2突变导致的SHL表型，从
2 000 bp—
1 000 bp— 在体水平研究 GPRASP2 的功能及其突变致聋的机
750 bp— 制，本研究拟选择巴马小型猪构建耳聋动物模型。
500 bp— 413 bp 396 bp
250 bp— 320 bp 348 bp 猪是除了灵长类动物以外在进化关系上与人最接
100 bp—
近的实验动物，并在诸多器官（包括听觉器官）的
解剖结构和发育遗传方面高度相似 ［13］ 。采用基因
M：DL2000 marker；1、2：未转染组 PCR 产物；3、4：Cas9⁃sgRNA⁃
编辑技术构建基因缺陷的耳聋模型猪可精确模拟
CDS⁃UP 转染组 PCR 产物；5、6：Cas9⁃sgRNA⁃CDS⁃Down 转染组 PCR
产物；-/+：无或加T7EN1酶。 人遗传性耳聋的疾病表型和病理过程，如杨仕明
图4 猪GPRASP2基因敲除靶点的T7EN1酶切验证 课题组利用乙基亚硝基脲（ENU）诱变构建了 MITF
Figure 4 T7EN1 cleavage assay of target sites in porcine 基因敲除小型猪模型，成功复制了人 Mondini 畸形
GPRASP2 WT KO 病伴听力损失的临床表型 ［21］ ；本课题组基于 CRIS⁃

WT KO
94kDa WT KO GPRASP2 PR/Cas9 介导的基因编辑技术成功构建了 OSBPL2
GPRASP2
94kDa — 94 kDa 基因敲除的巴马小型猪模型，首次精确模拟了人
GPRASP2
OSBPL2 基因突变导致的渐进性听力损失的临床
55kDa — 55 kDa 表型（DFNA67）和内耳听毛细胞的病理过程 ［13］ 。
?-tubulin
β⁃tubulin
55kDa ?-tubulin 本 研 究 利 用 CRISPR/Cas9 技 术 成 功 构 建 了
WT：野生型PFF；KO：GPRASP2基因敲除PFF。
GPRASP2基因敲除的PFF细胞系，为后续体细胞核
图5 GPRASP2基因敲除PFF的Western blot验证
Figure 5 Western blot assay of GPRASP2⁃deficient PFF 移植和重组胚胎构建提供合适的供体细胞，为构建
GPRASP2 基因敲除的巴马小型猪模型奠定了前期
生物学功能。 基础，以期为进一步探索GPRASP2基因突变致聋机
GPRASP2 作 为 GASP 家 族 成 员（GASP2）在 制与基因治疗提供合适的大动物模型。
GPCR 内吞后的分选过程中发挥着重要作用。GP⁃
［参考文献］
CR经配体刺激后，质膜表面的蛋白受体经G蛋白偶
联受体激酶磷酸化以及β⁃arrestins 作用下与 G 蛋白 ［1］ MYKYTYN K，ASKWITH C. G⁃protein⁃coupled receptor
signaling in cilia［J］. Cold Spring Harb Perspect Biol，
解偶联，通过网格蛋白有被小泡的协助完成内吞，
2017，9（9）：a028183
内吞后的分选途径一般包括再循环和降解 ［15］ 。目
［2］ ABU⁃HELO A，SIMONIN F. Identification and biological
前已经鉴定出多个受体再循环途径以及GPCR内吞
significance of G protein⁃coupled receptor associated sort⁃
［15⁃16］
后进入溶酶体降解途径的GASP ，涉及多方面的
ing proteins（GASPs）［J］. Pharmacol Ther，2010，126
生理功能。有研究表明GASP家族蛋白可作为肿瘤 （3）：244-250
的分子标志物指示肿瘤的发生发展，GASP1在多种 ［3］ XING G，YAO J，LIU C，et al. GPRASP2，a novel caus⁃
类型的肿瘤患者血清中都具有较高的表达量，包括 ative gene mutated in an X ⁃ linked recessive syndromic
乳腺癌、脑瘤、肝癌以及肺癌等 ［17］ ；GASP2和GASP3 hearing loss［J］. J Med Genet，2017，54：426-430
在术前和术后头颈鳞状细胞癌患者中的表达具有 ［4］ STEPHANIE E，DIETMAR H，KATHARINA S，et al. Co⁃
显著差异 ［18］ ；Horn 等 ［19］ 研究发现 GPRASP2 羧基端 chlea ⁃ specific deletion of Cav1.3 calcium channels ar⁃
rests inner hair cell differentiation and unravels pitfalls of
部分与亨廷顿蛋白（htt）的氨基端（polyQ）相互作用，
conditional mouse models［J］. Front Cell Neurosci，2019，
形成 htt⁃GPRASP2 复合物，参与受体胞吞作用和突
13：225
触后信号转导，影响受体的转运，而这一过程与亨
［5］ GUO W，YI H，REN L，et al. The morphology and electro⁃
廷顿舞蹈症发生有较大相关性；Edfawy 等 ［20］ 研究发
physiology of the cochlea of the miniature pig［J］. Anat
现 GPRASP2 能够通过代谢型谷氨酸受体（mGluR） Rec（Hoboken），2015，298：494-500
信号通路调控神经系统发育，且敲除GPRASP2基因 ［6］ 陈 伟，陈 磊，杨仕明，等. 荣昌猪遗传性听力缺陷家
导致小鼠出现自闭症谱系障碍样行为 ［20］ 。现有研 系的发掘与应用［J］. 中华耳科学杂志，2016，14（1）：
究提示GPRASP2与神经系统疾病相关；本课题组则 10-14