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第41卷第1期
· 6 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年1月
用BbsⅠ限制性内切酶对pX330质粒进行线性化，并 低温离心，提取总蛋白，经 SDS⁃PAGE 胶分离，转膜
连接退火产物，再转化感受态DH5α，挑单克隆菌落 至 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，加
至摇管，37 ℃培养 12~16 h，分装 1 mL 的菌液送测 GPRASP2 抗体（1∶1 000，Abcam 公司，英国）和β⁃tu⁃
序。测序验证后冻存菌液，并小提质粒。 bulin 抗体（1∶1 000，北京翼飞雪），4 ℃孵育过夜，
1.2.3 细胞转染和单克隆细胞的筛选 TBST 洗膜后室温孵育二抗（羊抗兔或羊抗鼠）2 h，
PFF培养于含16%胎牛血清的DMEM培养基含 TBST洗膜后，化学发光仪（Bio⁃Rad公司，美国）检测
中，待细胞汇合度达到90%后，以0.05%胰蛋白酶消 蛋白表达情况。
化并离心收集细胞；取 1 μg pCMV td⁃tomato 分别与
2 结 果
空载pX330质粒、靶向猪GPRASP2基因CDS上游和
下游的重组pX330⁃CDS⁃UP/pX330⁃CDS⁃DOWN质粒 2.1 人/猪GPRASP2基因的分子进化关系与同源性
各 5 μg 共转染 PFF；参照 Lonza 核转试剂盒说明书 分析
配制核转液，使用程序U⁃023进行核转，转染后24 h 包含猪和人在内20个物种的GPRASP2系统进
加 1 mg/mL 的 G418 进行药筛培养，隔天换液，并根 化树如图 1A 所示，分值越高的节点其置信度也越
据细胞生长状态调整G418用药浓度。9~10 d后，显 高。进化树显示人/猪GPRASP2在分子进化上亲缘
微镜观察单克隆位置，并在皿底标记；弃皿中培养 关系更近，且人/猪GPRASP2蛋白同源性较高，氨基
液，PBS清洗2遍，将克隆环放置于皿底单克隆位置， 酸序列一致性达 86%（图 1B），且主要功能结构域
加0.05%胰蛋白酶消化细胞，转接于24孔板中，待细 Arm2的氨基酸序列一致性高达94%。
胞长满后再转接至12孔板中培养，孔板盖上标记克 2.2 人/猪GPRASP2蛋白结构分析
隆编号和日期；12 孔板中细胞长满后，取部分细胞 采用 DNAstar 软件中 Protean 模块的 Chou⁃Fas⁃
用NP40裂解液裂解，提取基因组DNA，PCR 扩增靶 man 算法对人/猪 GPRASP2 蛋白进行二级结构分
点区域，CDS1 上游引物 5′⁃TTCTGCACTCTGTTG⁃ 析 。 人/猪 GPRASP2 蛋 白 及 其 主 要 功 能 结 构 域
GCTGAG ⁃ 3′ ，下 游 引 物 5′ ⁃ AGCAGCAGAAC⁃ Arm2 的二级结构具有相近的α螺旋、β折叠、β转角
CAGACTCATT⁃3′，扩增产物长度 722 bp。反应条 的数量（表2），提示人/猪GPRASP2蛋白的二级结构
件：95 ℃预变性 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 相似。蛋白三维结构模拟显示人/猪GPRASP2的主
min，35 个循环；PCR 产物经切胶回收，连接 pMD18⁃ 要功能结构域Arm2的三维结构相似。考虑到人/猪
T 载体，连接产物转化感受态 DH5α中，每板挑取 12 GPRASP2在分子进化上亲缘关系相近且高度同源，
个菌落送公司测序；测序结果与猪GPRASP2基因序 推测人/猪 GPRASP2 蛋白具有相似的生物学功能，
列（XM⁃003135261.4）进行比对，鉴定得每个克隆细 这还需从在体水平进一步验证。
胞的基因型。 2.3 重组打靶质粒和 GPRASP2 基因敲除 PFF 的基
1.2.4 重组载体打靶效率验证 因型鉴定
提取转染细胞的基因组DNA，同前PCR扩增；切 测序结果如图 2 所示，pX330 中分别插入了
胶回收 PCR 产物（5 μL），加入 2 μL 10×NEBuffer GPRASP2基因CDS上游和下游靶点的sgRNA序列。
2.0，用 Nuclease⁃free 水补足至 19 μL，在 PCR 仪中 经测序鉴定，共获得42个阳性单克隆，其中5个
进行退火反应：95 ℃ 10 min，再逐渐冷却至室温； 为双等位突变的阳性单克隆（表3），包含5种等位基
退火结束后，取 9.5 μL 退火产物加入 0.5 μL T7EN1 因突变型（图 3），4 种导致 GPRASP2 编码氨基酸的
酶，剩余 9.5 μL 退火产物加 0.5 μL 去离子水（即不 移码和蛋白截短。
加酶的对照组），混匀后 37 ℃下反应 15 min；加入 2.4 GPRASP2基因敲除效率的验证
0.5 μL 蛋白酶K使T7EN1酶失活，采用1.5%琼脂糖 如图4所示，转染pX330⁃CDS⁃UP和pX330⁃CDS
凝胶电泳分析和检测打靶效率。根据条带灰度值， ⁃DOWN 重组打靶质粒的 PFF 对应的 PCR 产物均可
计算细胞转染敲除效率，敲除效率=100×［1-（1-裂 观察到明显剪切条带，敲除效率分别为20%和15%，
解产物占比）］。 选取敲除效率较高的pX330⁃CDS⁃UP重组质粒用于
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1.2.5 Western blot验证 后续转染和单克隆PFF筛选。
分别取野生型和GPRASP2基因敲除的PFF，加 2.5 GPRASP2基因敲除PFF的Western blot验证
入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液后超声破碎和 采用 Western blot 随机验证其中 1 株 GPRASP2
