Page 11 - 南京医科大学自然科学版第1期

第41卷第1期 张 敏，姚 俊，鲁雅洁，等. GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立［J］.
2021年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：004-010 · 5 ·

G 蛋白偶联受体（G protein⁃coupled receptor， Biolabs公司，美国）；琼脂糖凝胶回收试剂盒（Qiagen
GPCR）是人类基因组中最庞大的膜蛋白家族，它们 公司，德国）；质粒小提中量试剂盒和 DH5α感受态
是一类具有 7 次跨膜螺旋结构的超家族 ，主要通 细胞（北京天根生化科技公司）；Basic Nucleofector TM
［1］
过与配体结合并发生内吞后发挥作用，可调控生物 Kits 和细胞转染仪（Lonza 公司，德国）；DMEM 培养
体内许多重要的生理过程。G蛋白偶联受体相关分 基、胎牛血清、胰酶、青/链霉素双抗和 PBS 缓冲液
选蛋白（GPCR associated sorting protein，GASP）主要 （Gibco公司，美国）；pMD18⁃T载体（TaKaRa公司，日
在GPCR内吞后的分选过程发挥重要作用，通过与受 本）；引物和磷酸化的寡核苷酸序列由南京金斯瑞
体的羧基端相互结合，从而介导GPCR进入降解或再 公司合成。
［2］
循环途径，从而调控相关信号转导 。GPRASP2 为 1.2 方法
GASP 家族成员（即 GASP2），参与 GPCR 活性调节， 1.2.1 人/猪GPRASP2的生物信息学分析
并与肿瘤发生、细胞生长及衰老、生理调节和溶酶 采用 MEGA7.0 软件，选取包括猪和人等 20 种
体降解等生理过程相关 。本课题组在 1 个 X 连锁 物 种 进 行 GPRASP2 基 因 亲 缘 性 分 析 ，并 绘 制
［2］
隐性遗传耳聋家系中首次定位和发现 GPRASP2 基 GPRASP2的系统进化树。采用GeneDoc 软件，比对
因突变（c.1717_1718GC＞AA，p.A573N）与综合征性 人/猪 GPRASP2 氨基酸序列，并进行同源性和保守
耳聋（syndromic hearing loss，SHL）的发生相关 。为 性分析。
［3］
进一步推进对GPRASP2基因突变/功能缺陷致聋的 采 用 DNAstar 软 件 中 Protean 模 块 对 人/猪
分子病因学的理解，还需要在模型动物水平进行耳聋 GPRASP2 蛋白进行二级结构分析，以 Chou⁃Fasman
基因型/表型相关性的研究和GPRASP2功能的探讨。 算法预测蛋白α螺旋、β折叠、β转角的比例。采用
随着基因编辑技术的发展，构建基因缺陷的动 Swiss⁃Model在线工具对人/猪GPRASP2蛋白的三维
物模型为从病理与病因学上研究遗传性耳聋提供 结构进行模拟（https：//www.swissmodel. expasy.org/），
了有效途径。小鼠等啮齿类模型动物的内耳发育、 因 Protein Data Bank（PDB）数 据 库 中 未 检 索 到
［4］
遗传和解剖结构与人类差别较大 ，无法精确模拟 GPRASP2 同源蛋白的结构，故采用从头计算法对
人内耳的生理功能和病理过程。猪在分子进化上 人/猪GPRASP2蛋白主要功能结构域Arm2（含250个
与人亲缘关系相近，在遗传、生理生化、器官发育和 氨基酸残基）进行三维结构模拟。
病程发展等方面，特别在内耳发育、听器结构和功 1.2.2 CRISPR/Cas9的靶点设计和打靶载体构建
能上与人相似 ［5-6］ ：猪出生时耳蜗形态已基本发育成 利用 CRISPR 靶点在线设计工具（http：//crispr.
熟并已具备正常听力，这与人胚胎时期的内耳发 mit.edu/），分别在猪 GPRASP2 基因编码区（coding
育过程一致 ［7-8］ ；猪的内耳耳蜗形态以及螺旋器结 sequence，CDS）的上游和下游各设计1对20 bp左右
构和功能与人相似；猪的听阈和敏感听力范围与 的sgRNA 寡核苷酸序列（sgRNA oligo，表1），由南京
人 接 近 ［9］ ，具 有 相 似 的 听 性 脑 干 反 应（auditory 金斯瑞合成5′端磷酸化修饰的sgRNA oligo。
［10］
brainstem response，ABR） ；巴马小型猪体型大小 表1 GPRASP2靶点位置及sgRNA寡核苷酸序列
合适，遗传背景明晰，应用于遗传性耳聋的研究更 Table 1 GPRASP2 targeting loci and sgRNA oligonucleo⁃
具优势 ［10］ 。本研究采用 CRISPR/Cas9 介导的基因 tide sequence
编辑技术成功获得猪 GPRASP2 基因敲除的猪胎儿 Oligo名称 序列（5′→3′）
成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts，PFF），为构建 GPRASP2⁃CDS⁃UP⁃F caccGCCCAATGGTGGTCCGGCCTA
GPRASP2 基因缺陷的巴马小型猪模型和在体水平 GPRASP2⁃ CDS⁃UP⁃R aaacTAGGCCGGACCACCATTGGGC
探索 GPRASP2 的致聋机制奠定了实验基础。 GPRASP2⁃CDS⁃DOWN⁃F caccGGAAACCCTTGCTCATAGCG
GPRASP2⁃CDS⁃DOWN⁃R aaacCGCTATGAGCAAGGGTTTCC
1 材料和方法
载体构建步骤主要包括oligo退火、载体酶切和
1.1 材料 连接 ［11-13］ 。将合成的 sgRNA oligo 以去离子水稀释
PFF由南京医科大学江苏省异种移植重点实验 至 100 μmol/L，反应体系（10 μL）：正链 oligo 1 μL，
室提供；pX330 质粒（Addgene 423230）、带 G418 抗 反链 oligo 1 μL，去离子水 8 μL；PCR 仪设置退火程
性标记的 pCMV td⁃tomato 质粒（Clontech 公司，日 序：37 ℃孵育 30 min，95 ℃孵育 5 min，再以 5 ℃/min
本）；BbsⅠ限制性内切酶和 T7EN1 酶（New England 速度逐渐降温至 25 ℃；退火后将 oligo 稀释 250 倍。