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第41卷第11期
               ·1570 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年11月


                  草酸钙结石是泌尿系结石中最常见的类型，约                          合培养 24 h；α⁃硫辛酸（α⁃lipoic acid，α⁃LA）干预组
              占 80%以上 。草酸钙结石的形成过程中，高草酸                          同时给予一水草酸钙结晶（146 μg/cm）和α⁃LA（1×
                        ［1］
                                                                                                  2
              尿及草酸钙结晶会使肾小管上皮细胞发生氧化应                             10 mol/L），并联合培养 24 h；优克龙干预组同时给
                                                                  -4
              激损伤，从而促使草酸钙结晶附着于肾小管上皮细                            予一水草酸钙结晶（146 μg/cm）和柳栎浸膏提取物
                                                                                            2
              胞表面，导致结晶滞留，诱发草酸钙结石的形成。                            （30 μg/mL），并联合培养24 h。
              我们既往研究也同样表明，在草酸钙结晶导致的肾                            1.1.3 主要试剂
              小管上皮细胞损伤中发生了显著的氧化应激过程，                                 动物用优克龙及细胞用柳栎浸膏提取物（本院
              且可能参与了肾小管上皮细胞的损伤以及后续的                             提供）；乙二醇溶液、氯化铵溶液（天津市广成化学
              结石形成 。然而，目前临床上尚缺乏对草酸钙结                            试剂有限公司），葡萄糖酸钙溶液（四川省维克奇生
                      ［2］
              晶导致的肾小管上皮细胞损伤的有效治疗措施，因                            物科技有限公司）；实验用丙二醛（malonaldehyde，
              此，进一步探究草酸钙结石形成的机制及其临床干                            MDA）及超氧化物歧化酶（superoxidative dismutase，
              预措施具有十分重要的实用价值。                                   SOD）ELISA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公
                  优克龙是一种新型植物提取剂，主要成分为柳                          司）；Beclin 1、活化 Caspase 3、p38 MAPK 及磷酸化
              栎浸膏提取物，提取物中含有大量的鞣酸物质，近                            p38 MAPK抗体（Abcam公司，英国）；α⁃LA（Sigma公
              年来被国内外临床研究证实可促进泌尿系结石的                             司，美国）。
              排出 。在大鼠肾结石模型中，研究人员观察到优                            1.2  方法
                  ［3］
              克龙干预后，大鼠尿液中的尿钙水平以及氧化应激                            1.2.1 尿液样本收集及检测
              水平显著降低，且肾结石的形成受到抑制，提示优                                 分别将建模第 28 天的 3 组大鼠置于代谢笼中
              克龙具有抗氧化应激的作用 。然而优克龙对泌尿                            收集 24 h 尿液，加入甲苯防腐。尿钙、尿镁均采用
                                       ［4］
              系结石形成的影响及机制仍不明确，且缺乏相应的                            全自动生化分析仪（Beckman公司，美国）检测，通过
              研究。鉴于此，本研究通过大鼠草酸钙结石模型和                            离子色谱仪（Metrohm 公司，瑞士）检测各组大鼠尿
              草酸钙细胞模型，探究优克龙对草酸钙结石形成的                            液中草酸及枸橼酸盐的水平。
              调控作用及可能机制。                                        1.2.2 标本收集及HE染色
                                                                     分别收集3组大鼠在建模第28天的肾脏，并分
              1  材料和方法
                                                                别置于石蜡固定及液氮保存。肾组织经石蜡固定、
              1.1  材料                                           HE 染色后，在倒置显微镜下随机选取 5 个视野拍
              1.1.1 实验动物及模型构建                                   照，比较3组大鼠肾组织中草酸钙结晶的数量。
                  本研究用大鼠均为SPF级雄性SD大鼠，月龄3个                       1.2.3 免疫蛋白印迹（Western blot）法检测蛋白水平
              月，体重 150~200 g，购自北京维通利华公司。所有                           分别提取 3 组大鼠肾组织的总蛋白和 3 组细
              大鼠饲养于南京医科大学实验动物中心，并于适应                            胞的总蛋白，检测上述蛋白中自噬、凋亡以及相关
              性饲养1周后，随机将上述大鼠分为对照组、模型组                           通路的磷酸化水平。采用 BCA 法检测组织或细胞
              和优克龙干预组，每组10只。其中，对照组自由饮用                          的蛋白浓度，并行电泳、转膜、封闭，分别给予相应一
              灭菌水。模型组和干预组采用2%氯化铵2 mL/d灌胃                        抗孵育过夜，二抗孵育 2 h，加入 ECL 发光液进行曝
              14 d、10%葡萄糖酸钙 1.5 mL 腹腔注射 14 d，并给予                光。曝光条带采用Image J软件进行半定量分析。
              持续1%乙二醇自由饮水满28 d。此外，干预组采用                         1.2.4 细胞上清氧化应激指标的检测
              灌胃方式连续给予优克龙100 mg/kg，维持28 d。优                          分别提取3组细胞的上清，并采用酶联免疫吸附
              克龙均采用 1 mL 橄榄油溶解，现配现用，对照组和                        测定法（enzyme⁃linked immunosorbent assay，ELISA）
              模型组均给予1 mL橄榄油灌胃处理。                                和相关试剂盒，依照试剂盒的操作方法检测 3 组细
              1.1.2 细胞、分组及干预                                    胞上清中MDA及SOD水平。
                  人肾小管上皮细胞系（HK⁃2）（武汉益普生物技                       1.3  统计学方法
              术有限公司）培养于RPMI 1640培养基中，并随机分                            本研究的所有资料均采用 SPSS 17.0 进行分析
              为对照组、模型组和柳栎浸膏提取物干预组。其                             处理。定量资料均采用均数±标准差（x ± s）的方式
              中，对照组培养于 RPMI 1640 培养基中，无任何干                      表示，两组之间的比较均采用t检验，多组之间的比
              预；模型组给予一水草酸钙结晶（146 μg/cm），并联                      较采用方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
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