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第41卷第2期        郭苗苗，刘龙飞，谢梦晓，等. GCN5调控sublytic C5b⁃9诱导大鼠肾小球系膜细胞表达Cyclin D1
                  2021年2月          及致SOX9的乙酰化修饰［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（02）：160-165                 ·161 ·


                    系膜增生性肾炎（mesangial proliferative glomer⁃       体（Ac⁃K⁃103）（CST公司，美国）。单克隆SOX9抗体
                ulonephritis，MsPGN）是人类常见的肾小球疾病，其                 （sc⁃166505，Santa Cruz 公司，美国）。多克隆 Cyclin
                病变特征是肾小球系膜细胞（glomerular mesangial                 D1抗体（Abcam公司，美国）。
                cell，GMC）的异常增生和细胞外基质（extracellular                1.2  方法
                matrix，ECM）的过量堆积，最终可致肾纤维化和硬                       1.2.1 大鼠GMC的培养
                  ［1］
                化 。大鼠 Thy⁃1N 是一种普遍用于 MsPGN 研究的                        将大鼠 GMC 细胞株接种于含有 MEM 完全培
                动物模型 。本课题组以往研究已表明，Thy⁃1N 发                        养液（10%胎牛血清）中培养48 h。当细胞融合度达
                        ［2］
                病具有亚溶解 C5b⁃9（sublytic C5b⁃9）的依赖性。体                到80%~90%时，行细胞传代并继续培养。
                外用 sublytic C5b⁃9 刺激 GMC 后可引起细胞增生和                1.2.2 Sublytic C5b⁃9刺激GMC最佳剂量的确定
                产生促炎因子等       ［3-4］ ，但截至目前，有关sublytic C5b⁃            将 GMC 种于 MEM 完全培养液中，当融合达
                9促进GMC增生的分子机制并不十分清楚。                              60%时，用不同浓度的 Thy1Ab 致敏 30 min，再用不
                    本课题组前期研究发现，在Thy⁃1N大鼠发病早                       同浓度的NHS（含补体）进行孵育。然后，采用乳酸
                期的肾组织和受 sublytic C5b⁃9 刺激的 GMC 中，具                脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）法检查 GMC 溶
                有组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase，             解的百分率。GMC 溶解率小于 5%称为亚溶解

                HAT）活性的GCN5和转录因子SOX9以及Cyclin D1                  （sublytic）剂量  ［3-4］ 。本研究最终确定以 5%Thy1Ab
                的表达均同期上调。已知GCN5既可乙酰化修饰组                           与3%NHS作为形成sublytic C5b⁃9的最佳剂量。
                蛋白和非组蛋白（如转录因子），又能作为辅助激活                           1.2.3  GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1表达水平的
                                     ［5］
                因子促进靶基因的转录 。再者，SOX9也可促进肿                          测定
                瘤细胞的增殖       ［6-7］ ，而 Cyclin D1 的表达升高则能诱              GMC 分组处理：将 GMC 分为 6 组（n=3），即①
                导细胞从G1期进入S期 。提示这3种基因的表达                           MEM 组：仅用 MEM 培养；②Thy⁃1Ab 组：给 Thy⁃1
                                     ［8］
                上调均是细胞增殖重要的调控因子。鉴于GCN5和                           Ab（50 μL/mL）致敏 30 min，缓冲液洗涤后加 MEM
                SOX9分别是一种兼有HAT的转录辅激活因子和含                          培养；③Thy⁃1 Ab+HIS 组：用同量 Thy⁃1 Ab 致敏
                锌指结构的转录因子，而Cyclin D1又是细胞周期家                       30 min，洗涤后加 HIS（30 μL/mL）继续培养；④Thy⁃1
                族的一个成员，故在sublytic C5b⁃9刺激的GMC中升                   Ab+C6DS 组：同量 Thy⁃1 Ab 致敏 30 min，洗涤后加
                高的 GCN5 对 Cyclin D1 基因表达有何影响，以及                   C6DS（30 μL/mL）继续培养；⑤Thy⁃1 Ab+C6DS+C6
                GCN5可否乙酰化修饰SOX9目前并不知晓，本研究                         组：同上 Thy⁃ Ab 致敏 30 min，洗涤后加入 C6DS
                对此进行了探讨。                                         （30 μL/mL）及 C6 蛋白（2 mg/L）再培养；⑥Sublytic
                                                                  C5b⁃9 组：加同量 Thy⁃1 Ab 致敏 30 min，洗涤后加
                1  材料和方法
                                                                  NHS（30 μL/ml，提供补体）继续培养。
                1.1  材料                                               Western blot 实验：上述分组 GMC 在实验 3 h 时
                    大鼠GMC细胞株（HBZY⁃1）购自武汉大学中国                      提取蛋白，用 Western blot 检测 GCN5、SOX9 和 Cy⁃
                典型培养物保藏中心。pIRES2/GCN5（带Flag标签）                    clin D1的表达。将GMC裂解物离心10 min，取20 μg
                和pcDNA3.1⁃SOX9（带HA 标签）过表达质粒、GCN5                  蛋白行 SDS⁃PAGE 胶电泳，先 45 V恒压浓缩再120 V
                酶活性失活突变质粒（570 位谷氨酸突变为丙氨                           电泳 2 h，接着用 0.3 A 恒流湿转 120 min，将蛋白转
                酸，简称ΔGCN5）均由本课题组刘龙飞博士构建并                          印到 PVDF 膜上。之后分别加入 GCN5、SOX9、Cy⁃

                惠赠。此外，pGL3⁃Cyclin D1 启动子全长（+105~                  clin D1一抗，4 ℃过夜。漂洗后用HRP 标记的二抗
                +130 nt）质粒由本课题组谢梦晓博士构建并惠赠。                        孵育1 h，最后用ECL化学发光试剂检测               ［3-4］ 。
                    多克隆兔抗Thy⁃1 Ab由本实验室制备保存                ［3-4］ 。  1.2.4  过表达或沉默GCN5对Cyclin D1基因启动子

                补体来自健康志愿者新鲜血清（normal human se⁃                    活性的影响
                rum，NHS）。人补体 C6 缺陷血清（C6DS，Comple⁃                     GMC 分组处理：将 GMC 转染不同质粒进行分
                ment Technology 公司，美国）。补体热灭活血清                    组（n=3）：①pIRES2 组；② pIRES2⁃GCN5 组；③shC⁃
               （heat inactive serum，HIS）是指 56 ℃ 30 min 灭活的        TR 组；④shCTR+sublytic C5b⁃9 组；⑤shGCN5+sub⁃
                正常人血清。重组人C6（北京义翘神州生物技术有                           lytic C5b⁃9 组。①、②组用 Lipofectamine 2000 将
                限公司）。单克隆 GCN5 抗体（C26A10）、乙酰化抗                     pIRES2 或 pIRES2⁃GCN5 质粒单独或分别与含有
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