Page 12 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第2期
·162 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年2月

Cyclin D1 启动子序列的荧光素酶报告基因质粒共 C5b⁃9 组。将 shCTR 或 shGCN5 质粒单独转染 GMC
转染GMC后48 h，而③、④、⑤组则同法将shCTR 或 后48 h，②和③组再行sublytic C5b⁃9 刺激3 h（所有分
shGCN5质粒单独或分别与含有Cyclin D1启动子序 组n=3）。SOX9乙酰化水平的测定同1.2.6所述。
列的荧光素酶报告基因质粒共转染GMC 48 h，再行 1.3 统计学方法
sublytic C5b⁃9 刺激3 h（过表达和小干扰质粒的转染 所有实验均独立重复 3 次，所得定量数据以均
效率验证以检查GCN5的表达水平确定）。 数±标准误（x ± sx ）表示，组间比较则采用单因素方差
荧光素酶报告实验：用 1×被动裂解缓冲液 分析，两两比较采用SNK法。应用GraphPad⁃prism软
（PLB）裂解处理后的 GMC，行荧光素酶报告实验测 件（版本5.01）进行统计学分析，P < 0.05为差异有统
定 Cyclin D1 启动子活性。步骤：先在检测管中加 计学意义。
入 25 μL 荧光素酶检测试剂Ⅱ，放入荧光发光仪
中，接着转移 2.5 μL PLB 裂解的细胞液到检测管 2 结 果
中，混合后检测萤火虫荧光素酶的活性，最后加入 2.1 Thy⁃1N 大鼠肾组织中 GCN5、SOX9 和 Cyclin
25 μL Stop&Glo Reagent 检测海肾荧光素酶的活 D1基因的表达
®
性。萤火虫荧光值/海肾荧光值的比值即为最终结 取Thy⁃1N大鼠发病3 h和正常兔血清（NRS）对
果 ［3-4］ 。 照鼠 3 h 的肾组织进行检查显示，Thy⁃ 1N 组的

1.2.5 过表达或沉默GCN5对Cyclin D1基因转录与 GCN5、SOX9 和 Cyclin D1 表达明显升高（P < 0.05，
表达的检查 图1）。
Cyclin D1 mRNA水平的测定：质粒转染GMC的 Thy-1N
Thy-1N
Thy-1N
Thy-1N
分组同1.2.4。用 Primer Premier 5 软件设计大鼠Cy⁃ A 对照组 Thy⁃1N组
-92 kDa
-92 kDa
-92 kDa
clin D1和β⁃actin qPCR引物。引物序列如下：Cyclin GCN5 -92 kDa
—92 kDa
D1上游5′⁃AGAGGGAGATTGTGCCATCC⁃3′，下游5′⁃
-56 kDa
-56 kDa
-56 kDa
-56 kDa
SOX9 —56 kDa
ACAAGA⁃ACCGGTCCAGGTA G⁃3′；β⁃actin 上游 5′⁃
Cyclin D1 —37 kDa
-37 kDa
-37 kDa
-37 kDa
Cyclin D1
Cyclin D1
-37 kDa
Cyclin D1 D1
Cyclin
TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA ⁃ 3′ ，下 游 5′ ⁃
—42 kDa
-42 kDa
-42 kDa
-42 kDa
CATCGGAA ⁃ CCGCTCATTGCCGATAG ⁃ 3′ 。 提 取 β⁃actin -42 kDa
GMC总RNA，取500 ng 总RNA 作模板，行逆转录制 B 6 GCN5
备 cDNA。Real⁃time PCR反应参数为：95 ℃，10 s预 SOX9 * *
变性；95 ℃，5 s，60 ℃，31 s，共 40 个循环。用β⁃actin 4 Cyclin D1 *
-ΔΔCT 。Cyclin D1 蛋白表 蛋白相对表达水平
作内参基因，计算公式为：2 2
达的测定同1.2.3所述。
1.2.6 Sublytic C5⁃9 刺激的 GMC 中 SOX9 乙酰化水 0
对照组（3 h） Thy⁃1N组（3 h）
平的鉴定
A：Western blot 电泳条带；B：半定量统计分析图。与对照组比
GMC分组处理同前1.2.3。SOX9乙酰化水平用
较，P < 0.05（n=3）。
*
免疫共沉淀（Co⁃IP）和Western blot 实验检测。按说 图1 Thy⁃1N大鼠肾组织中GCN5、SOX9和Cyclin D1蛋白
明书操作，每6孔板GMC加入200 μL IP 裂解液（含 的表达
PMSF 和磷酸酶抑制剂），提取蛋白后行Western blot Figure 1 GCN5，SOX9 and Cyclin D1 expression in the
检测，一抗为乙酰化抗体（Ac⁃K⁃103），实验步骤见 renal tissues of Thy⁃1N rat
1.2.3描述。
1.2.7 过表达GCN5和酶活性突变质粒（ΔGCN5）或 2.2 Sublytic C5b⁃9 刺激的 GMC 中 GCN5、SOX9 和
沉默GCN5基因影响SOX9乙酰化的检查 Cyclin D1蛋白的表达
GMC 分组处理：过表达 GCN5 和ΔGCN5 的分组 将 GMC 分为 MEM、Thy⁃1 Ab、Thy⁃1 Ab+HIS、
是：①HA⁃SOX9+pIRES2组，②HA⁃SOX9+Flag⁃GCN5 Thy⁃1 Ab+C6DS、Thy⁃1 Ab+C6DS+C6和sublytic C5b⁃
组，③ HA⁃SOX9+ΔGCN5组。分别转染相应质粒于 9 组。Western blot 检测发现，3 h 时，sublytic C5b⁃9
GMC中48 h。另沉默GCN5基因的分组是：①shCTR 组和Thy⁃1 Ab+C6DS+C6组的GCN5、SOX9和Cyclin
组；②shCTR+sublytic C5b⁃9组；③ shGCN5+sublytic D1表达明显增加（P < 0.05或P < 0.01，图2）。