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第41卷第2期 周 顺，王 勇，张 峰，等. 巨噬细胞中神经损伤诱导蛋白1在肝脏缺血再灌注损伤及
2021年2月 其炎症反应中的作用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（02）：166-172 ·167 ·

肝脏缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）损 （Sigma Aldrich 公司，美国）；蛋白裂解液 RIPA（Cell
伤可发生于部分肝切除术后、肝移植以及各种原 Signaling 公司，美国）；脂多糖（lipopolysaccharide，
因导致的休克，是术后器官功能恢复迟缓甚至出 LPS）（InvivoGen 公司，美国）；TNF⁃α ELISA 试剂盒、
现衰竭的重要原因 ［1］ 。肝脏 IR 损伤发病机制复 IL⁃6 ELISA试剂盒、IL⁃1β ELISA试剂盒（eBioscience
杂，巨噬细胞介导的无菌性免疫炎症反应在其中 公司，美国）；Ninj1⁃siRNA、Non⁃specific siRNA、siR⁃
扮演了极其重要的角色 ［2-3］ 。大量研究证实了外周 NA 转染试剂盒（Santa Cruz Biotechnology 公司，美
来源的巨噬细胞（infiltrating macrophage，iMɸ）在 IR 国）；兔抗人Ninj1一抗、羊抗兔二抗（Abcam公司，美
后被募集入肝脏介导继发性炎性反应从而加重肝 国），兔抗人GAPDH一抗（Cells Galing公司，美国）。
脏 IR 损伤 ［4-5］ 。 雄性C57BL/6小鼠60只，6~8周龄（南京江苏集

神经损伤诱导蛋白 1（nerve injury⁃induced pro⁃ 萃药康生物科技有限公司），饲养于南京医科大学
tein 1，Ninj1）是最初发现于神经损伤时施旺细胞中 动物实验中心。在建立模型之前，小鼠至少在动物
［6］
的一种黏附分子 ，以后的研究发现其在单核细胞、 房饲养1周。饲养环境为：温度20~25 ℃，湿度50%
内皮细胞、上皮细胞以及多种组织中均有不同程度 左右，正常昼夜更替，12 h 光照/12 h 无光照交替进
的表达 。最近研究表明，Ninj1能够调控外周单核 行的方式模拟，自由饮水进食。所有动物实验严格
［7］
细胞向炎症区域迁移的能力，参与调控体内多种炎 按照动物实验规范执行。

症反应。多发性硬化症患者外周单核细胞中 Ninj1 1.2 方法
的表达上调与其越过血脑屏障迁移至中枢神经有 1.2.1 人PBMC的提取
关，并且在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimen⁃ 肝门阻断组患者6例，年龄（61.3±4.6）岁，5例原
tal allergic encephalomyelitis，EAE）的小鼠模型中，抑 发性肝癌，1例肝脏炎性组织增生，手术方式均为肝
制Ninj1的表达能明显减少脑组织中巨噬细胞的浸 部分切除术，术中行第一肝门阻断；对照组患者 6
［8］
润，减轻炎症反应，改善组织病理学指标 。在小鼠 例，年龄（58.9±6.7）岁，均为原发性肝癌，5例行肝部
结肠炎模型中，髓系特异性敲除 Ninj1 的小鼠肠道 分切除术，1例行腹腔镜下肝部分切除术，术中未行
炎症较野生型小鼠明显减轻 。 肝门阻断。分别于术前、术后第 1、3 天采集患者外
［9］
目前，Ninj1 在肝脏 IR 损伤中肝内炎症反应的 周血行天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate amino⁃
作用尚未见报道。本研究收集肝部分切除术中行 transferase，AST）检测。本研究经医院伦理委员会
肝门阻断以及未行肝门阻断的患者术前及术后的 批准，所有患者并知情同意。
外周血标本，提取外周单核细胞（peripheral blood 肝部分切除术前 1 h 和术后 6 h 采集患者外周
mononuclear cell，PBMC）并分析 Ninj1 在两组患者 血标本。用 PBS 按照 1∶2 的比例稀释外周血，将稀
PBMC中的表达情况，进一步建立小鼠肝脏IR模型， 释好的外周血小心加入到含有5 mL Ficoll淋巴细胞
采用小干扰RNA（small interfering，siRNA）特异性敲 分离液的15 mL离心管中。室温下2 000 r/min离心
低巨噬细胞中Ninj1的表达，探讨Ninj1在肝脏IR后 20 min。离心结束，小心取出离心管，离心管分成
炎症反应中的作用和机制，为临床防治肝脏IR损伤 3 层，上层为血浆，下层为红细胞和粒细胞，中层为
提供新的思路。 淋巴细胞分离液，上层与中层之间有一白色云雾
层，即为淋巴细胞和单核细胞。移液枪插入云雾
1 材料和方法
层，小心吸取。PBS洗涤2次，用红细胞裂解液裂解
1.1 材料 红细胞，收集PBMC。
冷 冻 离 心 机（Eppendorf 公 司 ，德 国）；ABI 1.2.2 小鼠分组和IR手术方法
Prism7900 荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems 公 分组：假手术组（Sham 组）、IR 组、IR+NS（Non⁃
司，美国）；SDS⁃PAGE 电泳仪、酶标仪（Bio⁃Rad 公 specific）⁃siRNA组、IR+Ninj1⁃siRNA组。
司，美国）；显微镜（Leica公司，德国）；化学发光检测 IR 模型手术方法：水合氯醛腹腔注射麻醉小

仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；TRIzol（Invi⁃ 鼠，将小鼠固定于手术台上，碘伏、酒精消毒 2 遍。
trogen公司，美国）；逆转录试剂盒、SYBR Green Mas⁃ 取腹正中切口，剪开皮肤，经腹白线剪开腹膜。小
ter、定量 PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；BCA 蛋 拉钩充分暴露术野，生理盐水浸润棉签，充分显露
白浓度测定试剂盒（上海 Beyotime 公司）；胰蛋白酶 肝脏左叶、中叶，小心剪开肝胃韧带，游离第一肝