Page 18 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第2期
               ·168 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年2月


              门，用无损伤血管夹夹闭肝左、中叶脉管共干，观察                           个视野进行计数。
              肝脏缺血情况，计时。关腹缝合，将小鼠置于保温                            1.2.5  骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derived mac⁃
              毯上，维持麻醉状态和体温。缺血 90 min 后，再次                       rophages，BMDM）的分离培养和LPS刺激
              开腹，小心松开无损伤血管夹，恢复肝脏血流。关                                 将 6~8 周龄的雄性小鼠腹腔注射 120 μL 的 5%
              腹缝合，恢复血流后 6 h 收集下腔静脉血和缺血的                         水合氯醛麻醉后，脱颈处死。置入70%乙醇中浸泡
              肝脏组织标本。假手术（Sham）组基本操作相同，但                         5 min消毒。无菌剪刀剪开双侧后肢皮肤，将皮肤分
              只游离第一肝门，并不进行夹闭。                                   离至髋关节，小心离断髋关节，取下双侧后肢。将
              1.2.3 小鼠血清转氨酶检测                                   供体双侧后肢移至超净工作台，去除肌肉组织，仔
                  1 mL 注射器采取小鼠下腔静脉血，转入含有                        细剥离出胫骨和股骨。用无菌注射器吸取完全培
              EDTA 抗凝剂的离心管中，室温下 7 000 r/min 离心                  养基插入骨髓腔，反复冲洗骨髓腔，将骨髓移入离心
              8 min，收集上层血清样品。取50 μL血清采用自动                       管，移液枪反复混匀细胞。放入离心机，1 200 r/min
              生化检测仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和                          离心 5 min，取下层细胞，PBS 重悬，显微镜下计数。
              AST的水平。剩余血清样本置入-80 ℃冰箱保存。                         将骨髓细胞用红细胞裂解液处理3 min，再将骨髓细
              1.2.4 肝脏组织样本病理学检测                                 胞按照2×10 个/皿的密度分入10 cm细胞培养皿，加
                                                                           4
                  HE 染色：剪成小块型的肝脏组织样本放入 4%                       入含有 20%的 L929 上清配制的完全 DMEM 培养基
              多聚甲醛溶液中固定，脱水后石蜡包埋。将石蜡包                            培 养 4 d，用 含 有 20% 的 L929 上 清 配 制 的 完 全
              埋后的组织切成4 μm厚度置于载玻片中，进行苏木                          DMEM培养基换液，继续培养3 d。PBS清洗2遍，用
              精⁃伊红（HE）染色，中性树胶封片固定，显微镜下观                         0.25%的胰酶消化贴壁细胞，重新铺板，37 ℃培养箱
              察。肝脏损伤程度采用 Suzuki’s 评分标准（0~4 分）                   培养过夜。LPS 组用含有 500 ng/mL LPS 的完全
              进行分析。判断标准依据有无肝细胞坏死、肝窦充                            DMEM培养基刺激6 h，对照组（PBS组）用含同等体
              血、淤血，小叶中心水肿等进行评判。                                 积的 PBS 完全 DMEM 培养基继续培养 6 h。PBS 清
                  免疫组化：小鼠肝脏标本切片后用二甲苯浸泡                          洗 2 遍，用 0.25%的胰酶消化贴壁细胞，镜下计数，
              2次，每次10 min，利用不同浓度梯度乙醇分别浸泡                        用于后续实验。
              5 min 进行水化。清洗 3 次后在抗原修复液中进行                       1.2.6 RT⁃PCR实验
              抗原修复。3%双氧水⁃甲醇溶液处理切片 15 min。                            取适量肝组织或者 BMDM，采用 TRIzol 两步法
              CD11b 染色按照试剂盒操作说明进行，染色结果中                         逆转录合成cDNA，定量PCR分析Ninj1和炎性因子
                    +
              CD11b 巨噬细胞被染成黄褐色，200 倍镜下取 6~8                     的mRNA表达量。引物设计见表1。
                                                      表1   PCR引物序列
                                                 Table 1 Primer seguences of PCR
                    目的基因                        上游引物                                  下游引物
                    Ninj1            5′⁃TGAGGAGTATGAGCTCAACG⁃3′             5′⁃GATGTCCAGCATGCTCTCCGC⁃3′
                    TNF⁃α            5′⁃CAGGCGGTGCCTATGTCTC⁃3′              5′⁃CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG⁃3′
                    IL⁃6             5′⁃TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC⁃3′          5′⁃TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC⁃3′
                    IL⁃1β            5′⁃GCACTACAGGCTCCGAGATGAA⁃3′           5′⁃GTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGT⁃3′
                    GAPDH            5′⁃ATTCCACCCATGGCAAATTC⁃3′             5′⁃CGCTCCTGGAAGATGGTGAT⁃3′
              1.2.7 免疫印迹实验                                      蛋白酶消化，镜下计数，按2×10 个/孔重新铺至6孔
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                  人 PBMC 或者小鼠 BMDM 加入 1 mL 预冷的蛋                 板，用无抗生素的 DMEM 培养基培养过夜。按照

              白裂解液研磨均匀后冰上静置 30 min，12 000 r/min                 siRNA转染试剂盒说明书进行体外siRNA转染。实
              离心 15 min，取上清液，BCA 法测定蛋白质浓度。                      验分组为：PBS 组、LPS 组、LPS+NS⁃siRNA 组、LPS+
              SDS⁃PAGE 电泳、转膜后封闭，一抗 4 ℃摇床孵育过                     Ninj1⁃siRNA组。
              夜，电泳缓冲液洗膜3次，每次10 min，二抗孵育2 h，                          体内：巨噬细胞特异性表达甘露糖受体，采用
              加入电化学发光试剂显影，检测Ninj1蛋白表达水平。                        甘露糖偶联聚合体为载体，将 NS⁃siRNA 和 Ninj1⁃
              1.2.8 siRNA干扰                                     siRNA 与甘露糖偶联聚合体混合静置 20 min，在建
                  体外：将体外诱导成功的小鼠原代BMDM用胰                         立缺血再灌注模型4 h之前按照2 mg/kg通过尾静脉
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