Page 43 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第4期 邓 威，孟 颖，王晨星，等. miR⁃182在口腔鳞癌血清外泌体中的表达及其临床意义［J］.
2021年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：509-515 ·513 ·

高趋势，但与对照组无显著性差异（P＞0.05，图4A）， 2.0 2.0 P＜0.05
这可能与样本量较少有关，在病理上肿瘤浸润深度＞ 1.5
5 mm的患者血清外泌体内 miR⁃182含量相对于对照 1.5
组有明显升高（P＜0.05，图4B）。 miR⁃182相对表达量 1.0 miR⁃182相对表达量 1.0
2.5 HEK293细胞外泌体鉴定 0.5 0.5
运用超速离心法从HEK293细胞上清液中提取
外泌体。Western blot 实验显示外泌体组检测到外 0.0 0.0
对照组 OSCC 对照组 ＞5 mm的
泌体标志性蛋白 CD9 和 TSG101 的表达，而没有检 （n=18） （n=17） （n=18）OSCC（n=7）
测到胞浆蛋白Calnexin的表达（图5A）。透射电子显 图4 miR⁃182在血清外泌体中的表达情况
微镜观察发现有 40~150 nm 大小的囊泡样结构（图 Figure 4 Expression of miR⁃182 in serum exosomes
5B）。NTA显示外泌体样本中颗粒物大小分布的峰
值是98 nm，符合外泌体的粒径分布特点（图5C）。 现，红色荧光 Cy3 标记的 miR⁃182 antagomir（图 6A）

2.6 HEK293细胞外泌体加载miR⁃182 antagomir 与绿色荧光 PKH67标记的外泌体（图6B）两者存在
使用共孵育的方法将 Cy3 标记的 miR⁃182 an⁃ 共标记，呈黄色（图 6C），表明 miR⁃182 antagomir 加
tagomir 加载到外泌体中，倒置荧光显微镜下观察发 载到了外泌体中。

A B C
（ ×10 6 个/mL ）
HEK293 外泌体 10
CD9 24 kDa 8 98
TSG101 44 kDa 6 4
颗粒数
Calnexin 90 kDa 2
0
0 200 400 600
直径（nm）

A：Western blot检测出外泌体标志性蛋白CD9和TSG101；B：透射电子显微镜下观察外泌体形态（×26 000）；C：NTA观测外泌体的粒径分布。
图5 HEK293细胞外泌体鉴定
Figure 5 Characterization of exosomes in HEK293

A B C
A：红色荧光Cy3标记的miR⁃182 antagomir；B：绿色荧光 PKH67标记的外泌体；C：两者融合图像。
图6 miR⁃182 antagomir有效加载到外泌体中（×400）
Figure 6 Efficient loading of exosomes with miR⁃182 antagomir（×400）

2.7 加载 miR⁃182 antagomir 的外泌体抑制 CAL27 分离方法有差速超速离心法、超滤法、聚合物沉淀
细胞的增殖 法、微流控芯片分离法和免疫亲和法等 ［17］ ，ExoQuick

将加载 miR⁃182 antagomir 的外泌体与 CAL27 试剂盒是由美国SBI公司生产的基于聚合物沉淀法
细胞共培养，通过 CCK⁃8 检测发现，48、72 h 时 的外泌体提取试剂盒，具有操作简单、回收效率高
CAL27 细胞的增殖能力受到了明显抑制（P＜0.05， 和设备要求低等优点，适合小体积样本的外泌体提
图7）。 取。超速离心法是外泌体分离使用最广泛的方法，
但是外泌体的回收效率相对较低 ［18-19］ ，适用于体积
3 讨 论
较大外泌体含量较为丰富样本的外泌体分离，我们
外泌体是由细胞分泌的小囊泡，目前其主要的 采用这两种方法分别对血清和HEK293细胞培养上