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第41卷第4期
               ·510 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年4月


              of CAL27 cells.
             ［Key words］ miR⁃182；oral squamous cell carcinoma；exosome
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2021，41（04）：509⁃515］





                  口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，         国），miDETECT A Track   TM  miRNA qRT⁃PCR Starter
              OSCC）是人体最常见的 6 大恶性肿瘤之一，时至今                        Kit、cel⁃miR⁃39⁃3p标准品及引物、hsa⁃miR⁃182⁃5p引
              日其发病率仍在上升          ［1-2］ 。OSCC 具有侵袭性生长、           物、U6 引物（广州市锐博生物科技有限公司），
              局部浸润及远处转移、术后复发率高、预后差的特                            TRIzol（Invitrogen公司，美国），无水乙醇、三氯甲烷、
              点，并且通常在中晚期才被诊断               ［3-4］ 。OSCC 预后较      异丙醇（上海化学试剂有限公司），Dr. GenTLE™ Pre⁃

              差主要是肿瘤耐药、术后复发和转移所引起的，OS⁃                          cipitation Carrier（北京宝日医生物技术有限公司），
              CC的诊治对临床医生提出了巨大挑战 。                               ExoQuick Exosome Precipitation Kit（SBI 公 司 ，美
                                                ［5］
                  微小RNA（miRNA）是一种18~25个核苷酸长度                    国），PKH67绿色荧光染料（Sigma公司，美国），超敏
              的非编码RNA，miRNA可以通过互补相互作用结合                         ECL 发光液（江苏新赛美生物科技有限公司），鼠抗
              其靶 mRNA 的 3′非翻译区（UTR），从而调节基因表                     人 CD9 单克隆抗体、兔抗人钙联蛋白（Calnexin）多
                                                       ［7］
                ［6］
              达 。在人类癌症研究中发现 miRNA 的失调 ，且                        克隆抗体（Abcam公司，美国），兔抗人肿瘤易感基因
              miRNA 的表达水平与癌症的发展和进程密切相                           101 蛋白（TSG101）单克隆抗体（GeneTex 公司，美
              关，因此被认为是诊断癌症的预测性生物标志物                             国），CCK⁃8 检测试剂盒（上海东仁化学科技有限公
              之一 。外泌体是直径 40~150 nm 的细胞外囊泡，                      司），Cy3标记的miR⁃182 antagomir（上海吉玛基因公
                  ［8］
              具有双层脂质的膜结构 ，外泌体可以由多种体细                            司）。
                                   ［9］
              胞分泌并广泛存在于各种体液中，如尿液、血清、唾                           1.2  方法
              液等  ［10］ ，外泌体可以介导细胞间mRNA和miRNA的                   1.2.1 差异miRNA筛选
              传递，并且在受体细胞中产生相应的作用                   ［11］ 。研究          登陆 TCGA 网站 https：//cancergenome.nih.gov/，
              表明，外泌体中的miRNA与其起源细胞中的miRNA                        下载头颈鳞癌（head and neck squamous cell carcino⁃
              类似，且外泌体可以保护其包含的 miRNA 免受                          ma，HNSCC）的 569 份 miRNA⁃seq 三级数据，其中包
              RNase降解，使其稳定存在于循环中，表明它们可                          括 44 例癌旁组织及 525 例癌组织。打开 R 软件，
              能具有作为疾病诊断标志物及预后评价的潜在价                             edgeR 包进行差异分析，得到包括差异基因异常表
              值 ［12-13］ 。因此，本实验通过检测OSCC患者血清外泌                   达倍数（fold change，FC）及错误发现率（false disco⁃
              体中miRNA的表达水平，期望找到与OSCC疾病进展                        very rate，FDR）值的列表文件“diffmiSig.xls”，差异筛
              有关的外泌体miRNA，为抑制OSCC转移和复发提供                        选的标准为|log2FC|>1、FDR=0.05。
              新途径，以改善OSCC患者的生存率。                                1.2.2 血清样本收集
                                                                     采集空腹静脉血液5 mL于血清分离胶试管中，
              1  材料和方法
                                                                然后在室温下以3 000 r/min离心10 min。吸取上层
              1.1  材料                                           血清，转移分装至灭菌 EP 管中，于-80 ℃冰箱中保
                  新鲜的OSCC患者血清样本来源于南京医科大                         存。其中 OSCC 患者组 17 例，男 9 例，女 8 例，年龄
              学附属口腔医院口腔颌面外科，常规病理结果均为                            （59.5±10.4）岁；对照组 18 例，男 8 例，女 10 例，年龄
              OSCC，且手术前均未接受任何特殊的抗肿瘤治疗。                          （58.3±13.1）岁。两组在年龄、性别组成上差异无统
              对照组血清样本均从没有肿瘤疾病的个体获得。                             计学意义（P＞0.05）。
              本研究经医院伦理委员会批准，所有参与研究者均                            1.2.3 细胞培养
              知情同意。                                                  OSCC细胞株HN6与CAL27使用含10%胎牛血
                  HN6、CAL27、HEK293 及 HOEC 细胞株均购自                清及 1%青链霉素双抗的 DMEM/F⁃12 培养基培养，
              ATCC细胞库，DMEM/F⁃12培养基、DMEM高糖培养                     HEK293 与正常人口腔上皮细胞 HOEC 使用含 10%
              基、青/链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶、1×PBS 缓冲液                     胎牛血清及 1%双抗的 DMEM 培养基培养，均培养
             （Gibco 公司，美国），胎牛血清（Sciencell 公司，美                  于含5% CO2的37 ℃恒温培养箱中。
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