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第41卷第4期          邓   威，孟 颖，王晨星，等. miR⁃182在口腔鳞癌血清外泌体中的表达及其临床意义［J］.
                  2021年4月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：509-515                       ·511 ·


                1.2.4 外泌体提取                                       技 有 限 公 司 。 采 用 加 尾 法 试 剂 盒 miDETECT A
                    血清外泌体的提取采用美国 SBI 公司生产的                        Track miRNA qRT⁃PCR Starter Kit进行RT⁃qPCR检
                                                                       TM
                ExoQuick 试剂盒进行提取，根据说明书，4 ℃解冻                      测。检测细胞中 miR⁃182 表达水平时以 U6 作为内
                300 μL血清样本，然后将血清样本于 4 ℃条件下                        参，检测血清外泌体miR⁃182表达水平时以cel⁃miR⁃
                3 000 g离心15 min，弃去沉淀，吸取250 μL血清，加                 39⁃3p作为参照基因，采用2          ⁃ΔΔCT 法计算miR⁃182的相
                入 63 μL ExoQuick 试剂，上下颠倒 EP 管混匀，于                 对表达量。ΔCT （细胞）=CTmiRNA-CTU6，ΔCT （外泌体）=
                4 ℃冰箱中静置 40 min 后 4 ℃条件下 1 500 g 离心               CTmiRNA-CTcel⁃miR⁃39。
                30 min，弃上清然后同等条件下离心 5 min，移除残                     1.2.8 HEK293细胞外泌体加载miR⁃182 antagomir
                留试剂，最后加入100 μL PBS缓冲液溶解沉淀。                            miR⁃182 antagomir 是 miR⁃182 的拮抗剂，在 3′
                    HEK293细胞外泌体提取：将HEK293细胞培养                     末端胆固醇基修饰，5′端使用红色荧光Cy3标记，并
                至对数生长期，更换培养基（包含不含外泌体的                             用2′Ome修饰。miR⁃182 antagomir上的胆固醇基可
                10%胎牛血清，将胎牛血清以200 000 g离心18 h以                    以与外泌体膜相结合从而加载到外泌体中。参考

                耗尽外泌体），继续培养48 h收集上清液，参考Thery                      Zhang 等 ［15］ 的研究，将 100 nmol/L 胆固醇缀合的
                 ［14］
                等 的方法进行外泌体的提取，将上清液在4 ℃下以                          miR⁃182 antagomir 与 200 μL PBS 中的 100 μg 外泌
                1 000 g离心30 min，然后以10 000 g离心60 min，去             体在37 ℃下孵育1 h，用PBS重悬外泌体在140 000 g
                除死细胞和碎屑，然后使用L⁃80XP超速离心机（贝克                        的条件下离心90 min后，将外泌体重悬并在使用前
                曼）在4 ℃下以140 000 g离心90 min。将沉淀重悬于                  保存在-80 ℃。
                PBS后，再以140 000 g离心90 min。最后将外泌体沉                  1.2.9  荧 光 显 微 镜 下 观 察 外 泌 体 加 载 miR⁃182
                淀物重悬于PBS中，使用BCA蛋白定量试剂盒进行                          antagomir
                定量。                                                   用250 μL的DiluentC液稀释100 μL外泌体，加
                1.2.5  透射电镜及纳米粒子追踪分析（nanoparticle                 入1 μL的绿色荧光染料PKH67，室温孵育4 min；然
                tracking analyzer，NTA）                            后加入500 μL含有1% 牛血清白蛋白的PBS溶液防
                    外泌体样品用 1%戊二醛固定，并用 1%磷钨酸                       止过度染色，加入PBS稀释外泌体，再通过140 000 g
                染色，于透射电子显微镜下观察外泌体并拍摄图                             离心 90 min，收集外泌体并用 PBS 重悬，避光保存。
                片。使用 ZetaView 系统（Particle Metrix）进行 NTA，          在倒置荧光显微镜下观察miR⁃182 antagomir是否加
                追踪悬浮在 PBS 中外泌体的布朗运动，并且通过                          载到外泌体中。
                Stokes⁃Einstein方程生成尺寸分布数据。                        1.2.10 CCK⁃8实验
                1.2.6 Western blot实验                                  将 CAL27 细胞接种于 6 孔板中（每孔 2×10 个
                                                                                                             5
                    用 RIPA 裂解液提取细胞及外泌体总蛋白，将                       细胞），待细胞贴壁后更换为含有加载 miR⁃182
                等量的蛋白质样品加样并在十二烷基硫酸钠⁃聚丙                            antagomir外泌体的培养基，对照组的外泌体加载NC
                烯酰胺凝胶进行电泳（血清外泌体上样量为70 μg，                        （negative control，NC），培养 48 h。将细胞消化离心
                HEK293外泌体上样量为20 μg），然后转移到PVDF                     计数，接种于 96 孔板中，每孔 2 000 个细胞，每组设
                膜上。用 5%的脱脂奶粉溶液封闭 1 h，将膜与 CD9                      置 3 个复孔，37 ℃、5% CO2条件下培养，分别在 24、
                抗体、TSG101 抗体、Calnexin 抗体一起在 4 ℃下过                 48、72 h 时，向每孔加入 10 μL CCK⁃8 溶液孵育 2 h，
                夜，次日用 TBST 溶液洗涤 3 次，将膜在室温下与二                      用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度。
                抗孵育 1 h，再用 TBST 溶液洗涤 3 次。最后使用                     1.3  统计学方法
                ECL发光试剂盒将蛋白条带可视化。                                     所有数据均用 SPSS23.0软件进行统计学处理，

                1.2.7 RNA提取和RT⁃qPCR                               计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较用
                    采用 TRIzol 法提取细胞及外泌体总 RNA，在提                   t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
                取血清外泌体总 RNA 时加入线虫 cel⁃miR⁃39⁃3p 标
                                                                  2  结 果
                                             TM
                准品作为外参，加入 Dr. GenTLE Precipitation Car⁃
                rier提高RNA的回收效率。使用Nanodrop2000检测                   2.1 miR⁃182在HNSCC癌组织中上调
                RNA 纯度和浓度。线虫 cel⁃miR⁃39⁃3p 引物、hsa⁃                    对 TCGA 数据库中 HNSCC 样本的 miRNA 测序
                miR⁃182⁃5p引物、U6引物均购自广州市锐博生物科                      数据进行分析发现，有155个miRNA在HNSCC癌组
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