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第41卷第4期               沙博文，王 曾，周锦仁，等. 洛铂对肝癌肿瘤免疫及PD⁃L1表达的影响［J］.
                  2021年4月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：503-508                       ·505 ·


                正向引物：5′⁃GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT⁃3′，反                   表1 对照组和洛铂组患者一般资料和术中情况对比
                向引物：5′⁃GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG⁃3′。定               Table 1  Comparison of demographic data and intraoper⁃
                量反应在 ABI 7900 Fast Real⁃Time PCR system 上进                ative condition between control group and Loba⁃
                                                                          platin group
                行，反应条件：预热变性 95 ℃ 30 s；PCR 反应 95 ℃
                                                                          项目         洛铂组（n=40）对照组（n=33）P值
                5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。结果按照 2       ⁃ΔΔCt 法来计算       性别［n（%）］                                  0.98
                PD⁃L1的相对表达量，实验重复3次。                                 男                  34（85.0）    29（87.9）0
                1.2.4 Western blot实验                                女                  06（15.0）    4（12.1）
                    使用含 1％蛋白酶抑制剂和 1％磷酸酶抑制剂                         年龄（岁）             060.05 ± 10.52 059.58 ± 11.39 0.84
                RIPA裂解缓冲液（上海碧云天公司）裂解细胞，提取                          最大肿瘤直径（cm）         05.34 ± 3.36  05.82 ± 3.67 0.51
                细胞总蛋白。BCA定量蛋白浓度，加入蛋白上样缓                            术前检查
                                                                    白细胞（×10 个/L）      05.05 ± 1.55  05.01 ± 1.31 0.90
                                                                              9
                冲液（1∶4）后于 100 ℃金属浴 10 min。使用 SDS⁃
                                                                    中性粒细胞（%）         058.81 ± 10.21 60.54 ± 9.72 0.42
                PAGE 凝胶电泳分离蛋白后，转移到聚偏二氟乙烯
                                                                   Child⁃Pugh分级［n（%）］                        0.50
                膜上。将膜封闭 30 min，然后在 4 ℃与特定的一抗
                                                                    A                  38（95.0）    33（100.0）
                孵育12~14 h。此步骤中使用了PD⁃L1抗体、AKT抗
                                                                    B                   2（5.0）     0（0）00.
                体和 p⁃AKT 抗体（CST 公司，美国），GAPDH 作为内                   手术方式［n（%）］                                0.66
                参。TBST 溶液洗膜后室温孵育兔抗人 IgG 二抗                          局部切除               35（87.5）    29（87.9）0
               （CST 公司，美国）1 h，PBST 溶液洗膜后加曝光液后                       左半肝切除               3（7.5）     1（3.0）0
                曝光分析。以上实验均独立重复3次。                                   右半肝切除               2（5.0）     3（9.1）0
                1.2.5 流式细胞仪检测                                      术中出血量(mL)         407.83 ± 76.31 389.47 ± 80.54 0.53
                                                                   肿瘤TNM分期［n（%）］                             0.70
                    将Hep3B肝癌细胞分洛铂组（16 μmol/L），对照
                                                                    Ⅰ+Ⅱ                30（75.0）    26（78.8）0
                组（PBS），24 h后收集培养皿中的细胞，制作单细胞
                                                                    Ⅲ+Ⅳ                10（25.0）    07（21.2）0
                悬液。根据规程使用荧光染料标记的HLA⁃Ⅰ、TAP⁃
                                                                   手术时间（min）         128.26 ± 79.24 134.18 ± 78.45 0.73
                1、TAP⁃2 流式细胞抗体（eBioscience 公司，美国）。
                FACS 缓冲液洗涤 2 次后用流式细胞仪分析各组肝                        有所提高，同时降低Treg水平对抗肿瘤免疫逃逸。
                癌细胞中 HLA⁃I、TAP⁃1、TAP⁃2 表达情况。实验在                   2.2  洛铂诱导肝癌细胞抗原递呈组件表达升高
                相同条件下重复3次。                                            两组Hep3B肝癌细胞用流式细胞技术检测肝癌
                1.3  统计学方法                                        细胞表面HLA⁃Ⅰ、TAP⁃1、TAP⁃2。结果显示，洛铂组
                    应用 SPSS21.0 和 Graphpad8.0 软件对实验数据             肝癌细胞表面HLA⁃Ⅰ表达升高，抗原转运蛋白TAP⁃
                进行统计学处理。定量数据以均数±标准差（x ± s）表                       1、TAP⁃2表达升高（图1）。表明洛铂可能通过增加肝
                示，两组间比较采用 t 检验，计数资料以频数（百分                         癌细胞抗原递呈组件表达，提高抗肿瘤免疫。
                比）表示，两组间比较采用卡方检验，理论频数较低组                          2.3  洛铂诱导肝癌细胞PD⁃L1表达升高
                采用Fisher’s确切概率法。P < 0.05为差异有统计学                       Western blot、RT⁃qPCR 检测显示，洛铂处理的
                意义。                                               Hep3B、HepG2、SMMC⁃7721 肝癌细胞 PD⁃L1 蛋白表

                                                                  达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05，图 2）。
                2  结 果
                                                                  以上实验表明，洛铂能够诱导肝癌细胞 PD⁃L1 表达
                2.1  洛铂术中腹腔灌注能够调节患者抗肿瘤免疫                          增加，这可能增加其对宿主的免疫逃逸，导致耐药
                    两组患者一般临床资料比较差异无统计学意义                          性的产生。
               （P < 0.05，表1）。洛铂组患者手术前后外周血淋巴                       2.4  洛铂通过AKT通路调控肝癌细胞PD⁃L1表达
                细胞亚群检测显示：CD4 T 细胞、CD4 /CD8 比值升                        Western blot 检 测 洛 铂 组 和 对 照 组 Hep3B、
                                                  +
                                      +
                                                       +
                高，差异有统计学意义（P < 0.05），Treg 细胞下降                    HepG2、SMMC⁃7721肝癌细胞AKT、p⁃AKT、PD⁃L1表
               （P < 0.05），CD8 、NK 细胞无明显变化（P > 0.05）。              达情况。结果发现，两组 AKT 表达无明显差异，洛
                              +
                对照组患者手术前后 CD4 、CD8 、NK、Treg 细胞百                   铂组p⁃AKT、PD⁃L1表达升高（图3）。而加入AKT抑
                                        +
                                             +
                           +     +
                分率及 CD4 /CD8 比值差异无统计学意义（P >                       制剂后（MK2206 1 μmol/L）Western blot 检测发现
                0.05，表2）。说明洛铂腹腔灌注后患者细胞免疫功能                        Hep3B 肝癌细胞 PD⁃L1 表达相比于洛铂组下降（图
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